細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥基因四重PCR檢測試劑盒研制與應(yīng)用.pdf

1、本研究選擇4個(gè)氨基糖苷類藥物耐藥基因(ant(3")-Ⅰα、ant(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰα、ant(3)-Ⅱα)作為擴(kuò)增目的基因，根據(jù)多重PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了4對(duì)特異性四重PCR引物，應(yīng)用單基因PCR擴(kuò)增技術(shù)篩選出各個(gè)耐藥基因的陽性菌株，并進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果與GenBank中的相應(yīng)耐藥基因序列比較，同源性依次為ant(3')-Ⅱα(99.4％)、ant(6')-Ⅰb(99.3％)、ant(3")-Ⅰα，(99.2％

2、)、ant(3)-Ⅱα(95.3％)，證明了設(shè)計(jì)引物的正確性和特異性。陽性菌株(E99，107)做為本方法陽性對(duì)照。 在確定了4個(gè)單基因PCR擴(kuò)增體系各個(gè)參數(shù)的最佳值和可變動(dòng)范圍的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了4重PCR.擴(kuò)增體系的探索與優(yōu)化，其中包括Mg<'2+>濃度、dNTPs濃度、Taq酶濃度、引物濃度等組份濃度的優(yōu)化，退火溫度、循環(huán)次數(shù)等循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，成功建立了氨基糖苷類藥物耐藥基因的4重PCR檢測方法，最佳反應(yīng)體系如下

3、：10xPCR Buffer 5μl，MgCl<,2>(25 mmol/K)5μl，dNTP(2.5 mmol/L)4μl，模板5μl(菌液濃度相當(dāng)于MeFarland No 1.0)，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μ1)0.3μl，上下游引物(25 mmol/L)各添加：ant(3')-Ⅱα(0.5μl)、aac(3)-Ⅱα(0.9 μ1)、ant(6')-Ⅰb(0.8μl)、ant(3")-Ⅰα(1.8μ1)，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水

4、至50μl。最佳擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。4℃保存。 本研究還對(duì)PCR模板制備方法進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，通過添加60％甘油，保證了模板和Taq酶的穩(wěn)定性。采用的待檢細(xì)菌模板制備方法不需經(jīng)過繁瑣的細(xì)菌DNA提取過程，只需對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行兩次離心即可進(jìn)行測定。 對(duì)試劑盒特異性、敏感性、重復(fù)性和保質(zhì)期進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測

5、試驗(yàn)。檢測結(jié)果表明：本試劑盒具有很強(qiáng)的特異性，只能特異性擴(kuò)增出待檢測的耐藥基因；具有很高的靈敏度(3.6x10<'4> CFU/mL)；并且性能穩(wěn)定，有很好的批內(nèi)和批間重復(fù)性(100％)；試劑盒在-20℃下的保質(zhì)期為4個(gè)月。應(yīng)用本檢測試劑盒和傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法(K-B法)對(duì)30株細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行檢測，比較兩者檢測過程和檢測結(jié)果。結(jié)果表明，兩者檢出結(jié)果的符合率為90％，本試劑盒還具有靈敏度高、操作簡便，檢測時(shí)間短等特點(diǎn)。 應(yīng)用該試劑

6、盒對(duì)我國24個(gè)省45個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場484株分離菌和四川地區(qū)30只大熊貓59株腸道分離菌進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明：各個(gè)省市的分離菌檢出率存在很大的差異。其中，aph(3')-Ⅱα基因的最高檢出率為80％(北京)；aac(6)-Ⅰb基因的最高檢出率為26。7％(浙江)；ant(3")-Ⅰα基因的最高檢出率為73.3％(山東)；aph(3')-Ⅱα基因的最高檢出率為66.7％(甘肅)。4個(gè)耐藥基因的平均檢出率分別為：aph(3')-Ⅱα(46.1

7、％)、aac(6)-Ⅰb(11.6％)、ant(3")-Ⅰα(50.4％)、aph(3')-Ⅱα(42.8％)。在59株大熊貓分離菌中，aph(3')-Ⅱα的檢出率最高(10.17％)，其次為ant(3")-Ⅰα基因(5.08％)和aph(3')-Ⅱα基因?yàn)?1.69％)，而沒有擴(kuò)增出ant(3")-Ⅰb基因。本研究率先在國內(nèi)外建立了氨基糖苷類藥物耐藥基因四重PCR檢測試劑盒，并應(yīng)用該試劑盒對(duì)543株細(xì)菌進(jìn)行了耐藥基因的檢測，為氨基糖苷