細菌對氨基糖苷類藥物耐藥基因四重PCR檢測試劑盒研制與應用.pdf

1、本研究選擇4個氨基糖苷類藥物耐藥基因(ant(3")-Ⅰα、ant(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰα、ant(3)-Ⅱα)作為擴增目的基因，根據多重PCR引物設計原則，設計了4對特異性四重PCR引物，應用單基因PCR擴增技術篩選出各個耐藥基因的陽性菌株，并進行序列測定。測序結果與GenBank中的相應耐藥基因序列比較，同源性依次為ant(3')-Ⅱα(99.4％)、ant(6')-Ⅰb(99.3％)、ant(3")-Ⅰα，(99.2％

2、)、ant(3)-Ⅱα(95.3％)，證明了設計引物的正確性和特異性。陽性菌株(E99，107)做為本方法陽性對照。 在確定了4個單基因PCR擴增體系各個參數的最佳值和可變動范圍的基礎上，進行了4重PCR.擴增體系的探索與優(yōu)化，其中包括Mg<'2+>濃度、dNTPs濃度、Taq酶濃度、引物濃度等組份濃度的優(yōu)化，退火溫度、循環(huán)次數等循環(huán)參數的優(yōu)化。試驗結果顯示，成功建立了氨基糖苷類藥物耐藥基因的4重PCR檢測方法，最佳反應體系如下

3、：10xPCR Buffer 5μl，MgCl<,2>(25 mmol/K)5μl，dNTP(2.5 mmol/L)4μl，模板5μl(菌液濃度相當于MeFarland No 1.0)，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μ1)0.3μl，上下游引物(25 mmol/L)各添加：ant(3')-Ⅱα(0.5μl)、aac(3)-Ⅱα(0.9 μ1)、ant(6')-Ⅰb(0.8μl)、ant(3")-Ⅰα(1.8μ1)，最后補充滅菌雙蒸水

4、至50μl。最佳擴增反應參數為：94℃預變性5 min，94℃變性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。4℃保存。 本研究還對PCR模板制備方法進行了篩選和優(yōu)化，通過添加60％甘油，保證了模板和Taq酶的穩(wěn)定性。采用的待檢細菌模板制備方法不需經過繁瑣的細菌DNA提取過程，只需對細菌培養(yǎng)物進行兩次離心即可進行測定。 對試劑盒特異性、敏感性、重復性和保質期進行了系統(tǒng)的檢測

5、試驗。檢測結果表明：本試劑盒具有很強的特異性，只能特異性擴增出待檢測的耐藥基因；具有很高的靈敏度(3.6x10<'4> CFU/mL)；并且性能穩(wěn)定，有很好的批內和批間重復性(100％)；試劑盒在-20℃下的保質期為4個月。應用本檢測試劑盒和傳統(tǒng)藥敏試驗方法(K-B法)對30株細菌的耐藥性進行檢測，比較兩者檢測過程和檢測結果。結果表明，兩者檢出結果的符合率為90％，本試劑盒還具有靈敏度高、操作簡便，檢測時間短等特點。 應用該試劑

6、盒對我國24個省45個規(guī)?；B(yǎng)殖場484株分離菌和四川地區(qū)30只大熊貓59株腸道分離菌進行了檢測。結果表明：各個省市的分離菌檢出率存在很大的差異。其中，aph(3')-Ⅱα基因的最高檢出率為80％(北京)；aac(6)-Ⅰb基因的最高檢出率為26。7％(浙江)；ant(3")-Ⅰα基因的最高檢出率為73.3％(山東)；aph(3')-Ⅱα基因的最高檢出率為66.7％(甘肅)。4個耐藥基因的平均檢出率分別為：aph(3')-Ⅱα(46.1

7、％)、aac(6)-Ⅰb(11.6％)、ant(3")-Ⅰα(50.4％)、aph(3')-Ⅱα(42.8％)。在59株大熊貓分離菌中，aph(3')-Ⅱα的檢出率最高(10.17％)，其次為ant(3")-Ⅰα基因(5.08％)和aph(3')-Ⅱα基因為(1.69％)，而沒有擴增出ant(3")-Ⅰb基因。本研究率先在國內外建立了氨基糖苷類藥物耐藥基因四重PCR檢測試劑盒，并應用該試劑盒對543株細菌進行了耐藥基因的檢測，為氨基糖苷