活血化瘀通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠的保護作用及對血管緊張素Ⅱ1型受體的影響實驗研究.pdf

1、目的:本實驗通過建立糖尿病(DM)的動物模型，應(yīng)用活血化瘀通絡(luò)方對動物模型進行藥物干預(yù)性治療，通過觀察實驗動物的24小時尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、腎臟病理學(xué)變化、免疫組化法檢測腎組織中血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)的表達、RT-PCR法檢測腎組織AT1RmRNA的基因水平、Western-blot方法檢測腎組織中AT1R的蛋白含量，研究活血化瘀通絡(luò)方對糖尿病腎病的治療作用及可能機制，為臨床應(yīng)用提供理論

2、依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:選用清潔級健康雄性Sprague-Dauley大鼠80只，體重90g～120g。普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，測定尿蛋白、尿糖均為陰性者，隨機選取15只大鼠作正常組，余65只大鼠為造模組，造模組大鼠禁食不禁水12小時后一次性腹腔注射由0.1M枸櫞酸緩沖液(PH4.5)配制成的鏈脲佐菌素(STZ)55mg/kg，正常組注射等體積的枸櫞酸緩沖液，72小時后尾靜脈取血測血糖，連續(xù)三次隨機血糖值以≥16.7mmo

3、l/L為DM模型成功，3只大鼠血糖值未達標(biāo)予以剔除。造模組在DM模型成模后，隨機分成5組:模型組、活血方治療組、化瘀通絡(luò)方治療組、活血化瘀通絡(luò)方治療組、厄貝沙坦組。其中模型組大鼠14只，余各組各大鼠12只。成模一周后予以給藥，給藥組按大鼠與人體型系數(shù)折算出各組大鼠每日所需灌胃的劑量:丹參1.2g/kg/d，川芎0.96g/kg/d，地龍0.8g/kg/d，全蝎0.48g/kg/d，水蛭0.48g/kg/d，厄貝沙坦0.024g/kg/d

4、;正常組、模型組大鼠每天給予2ml純凈水灌胃，每日一次連續(xù)給藥共16周。16周末留取各組大鼠24小時尿液，測定24小時尿蛋白定量，大鼠尾靜脈取血測血糖及糖化血紅蛋白(HbA1c)，大鼠禁食不禁水12小時，稱量大鼠體重，10％水合氯醛麻醉動物，腹主動脈取血，摘取右腎剝離被膜后稱重，留取腎臟皮質(zhì)標(biāo)本，觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化及AT1R的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、實驗大鼠的一般情況
　　 正常組大鼠飲食正常，尿量正

5、常，肌肉豐滿，毛色光澤，反應(yīng)靈敏。其余各組大鼠在注射STZ后逐漸出現(xiàn)多飲，多食、多尿癥狀，實驗最后一周，與正常組相比，造模組及各給藥組大鼠反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，體型偏小，模型組大鼠的癥狀比各給藥組大鼠的癥狀嚴(yán)重。給藥期間造模組及各給藥組均有大鼠死亡情況:模型組死亡6只，活血化瘀通絡(luò)方治療組死亡1只，厄貝沙坦組死亡2只，死亡原因可能是由于糖代謝障礙所致血糖過高最終導(dǎo)致多臟器衰竭。
　　 2、各組大鼠體重、右腎重、肥大指數(shù)（右腎重/體

6、重）的比較
　　 與正常組相比，模型組和各治療組的體重明顯減輕(P＜0.05)，模型組與各治療組及各治療組之間體重?zé)o明顯的差異(P＞0.05);右腎重各組之間無顯著性差異（P＞0.05）;與正常組相比，模型組和各治療組的肥大指數(shù)明顯偏高(P＜0.05)，模型組與各治療組及各治療組之間無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 3、各組大鼠24小時尿蛋白定量的比較(24hUTP)
　　 與正常組相比，模型組和各治療組24

7、小時尿蛋白定量明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，各給藥組24小時尿蛋白定量明顯降低(P＜0.05);各給藥組之間比較，活血方治療組24小時尿蛋白定量高于其他治療組(P＜0.05);化瘀通絡(luò)方治療組、活血化瘀通絡(luò)方治療組、厄貝沙坦組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4、各組大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)的比較
　　 與正常組相比，模型組和各治療組的糖化血紅蛋白明顯升高(P＜0.05);模型組與各治療組及各治療

8、組之間的糖化血紅蛋白無顯著性的差異(P＞0.05)。
　　 5、各組大鼠血清肌酐(SCr)的比較
　　 各組大鼠血清肌酐水平無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 6、腎臟病理學(xué)改變
　　 6.1、光鏡觀察
　　 正常組大鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯肥大，未見基底膜增厚，未見系膜增生;模型組大鼠腎臟腎小球明顯肥大，腎小囊腔呈裂隙狀，基底膜明顯增厚，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)彌漫增生、系膜區(qū)增寬;與模型

9、組比較，各治療組大鼠腎小球均輕度肥大，腎小球基底膜均輕度增厚，均可見系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)輕度增生，活血方治療組表現(xiàn)略重于其他治療組。
　　 6.2、電鏡觀察
　　 正常組大鼠腎小球基底膜結(jié)構(gòu)完整，足細(xì)胞足突分布均勻，未見融合;模型組大鼠腎小球基底膜顯著性均質(zhì)樣增厚，足細(xì)胞足突廣泛融合;與模型組相比，各治療組大鼠也有類似的病理改變，但程度較輕，活血方治療組表現(xiàn)略重于其他治療組。
　　 7、免疫組化觀測腎組織AT1R的

10、表達
　　 正常組AT1R在大鼠腎臟的表達主要位于腎小管內(nèi)，以近端腎小管為主，遠(yuǎn)端腎小管、腎小球、腎血管周圍也可見少量表達。與正常組相比，模型組及各治療組的表達明顯增加(P＜0.05);與模型組相比，各治療組的表達明顯降低（P＜0.05）;活血方治療組的表達強于其他治療組（P＜0.05）;化瘀通絡(luò)方治療組、活血化瘀通絡(luò)方治療組、厄貝沙坦組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8、Western-blot方法檢測腎組織

11、AT1R蛋白的表達
　　 與正常組相比，模型組和各治療組蛋白表達量均增加(P＜0.05);與模型組相比，各治療組蛋白表達量均減少(P＜0.05);活血方治療組的蛋白表達量多于其他治療組(P＜0.05);化瘀通絡(luò)方治療組、活血化瘀通絡(luò)方治療組、厄貝沙坦組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 9、RT-PCR方法檢測腎組織AT1RmRNA表達水平
　　 與正常組相比，模型組和各治療組AT1RmRNA表達均增高(P

12、＜0.05);與模型組相比，各治療組AT1RmRNA表達均降低(P＜0.05);活血方治療組AT1RmRNA表達高于其他治療組(P＜0.05);化瘀通絡(luò)方治療組、活血化瘀通絡(luò)方治療組、厄貝沙坦組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、活血化瘀通絡(luò)方具有對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用。
　　 2、活血化瘀通絡(luò)方可以抑制AT1R的表達，與厄貝沙坦作用相似，提示活血化瘀通絡(luò)中藥對DN的治療作用可能與