大容量人天然抗體庫的構建、鑒定及初步應用.pdf

1、抗體藥物是近年來發(fā)展最快的生物技術藥物?？贵w藥物主要用于腫瘤、類風濕性關節(jié)炎等難治性疾病的診斷和治療。人源抗體一般不會產(chǎn)生免疫反應，能有效地激活人體的生物效應，半衰期長，因此，人源抗體研制技術是開發(fā)治療性抗體的關鍵。 傳統(tǒng)的雜交瘤技術制備單克隆抗體費時費力。噬菌體抗體庫技術的出現(xiàn)使抗體的制備產(chǎn)生了突破性的進展。噬菌體展示技術是一種基因表達產(chǎn)物與親和選擇結合的技術。它是將外源DNA與噬菌體外殼蛋白基因通過接頭相連，進而使外源DNA

2、產(chǎn)物與外殼蛋白融合，并展示在噬菌體表面。經(jīng)過幾輪吸附-洗脫-富集后，可獲得大量目的噬菌體富積。雖然噬菌體抗體庫技術應用的時間較短，但在腫瘤的診斷和治療、抗原表位分析、藥物設計等多個領域顯示出了巨大的發(fā)展?jié)撃芎蛷V闊的應用前景。 ScFv是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽連接而成的重組蛋白，是具有高親和力的最小抗體片段。其結構簡單，組織穿透力強，，在導向治療方面有著巨大的應用潛力。 腫瘤壞死

3、因子α(TNF-α)是一種具有復雜生物學活性的細胞因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，例如類風濕性關節(jié)炎(RA)等。因此，獲得一種人源中和性抗體以中和過量的循環(huán)TNF-α具有重要的臨床意義。 本研究旨在構建人天然噬菌體單鏈抗體庫，以TNF-α為靶標，從該抗體庫中篩選到抗TNF-α的單鏈抗體，以期有助于類風濕關節(jié)炎等疾病的診治，并說明該抗體庫可用于人源抗體的篩選。 在實驗中我們從未經(jīng)主動免疫的健康志愿者的外周血淋巴細胞中提

4、取總RNA，用RT-PCR擴增人抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因，得到了6種的VH家族基因，11種VL家族基因，這些抗體基因家族覆蓋了人抗體基因多樣性的95％以上。采用改進的SOEPCR法將VH基因和VL基因連接成人單鏈抗體(scFv)基因，并克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中，將連接產(chǎn)物電轉化大腸桿菌TG1，經(jīng)輔助噬菌體M13KO7超感染，構建了庫容為5.58×109的噬菌體單鏈抗體庫。采用BstNⅠ2酶切法證明，構建的噬菌

5、體單鏈抗體庫具有良好的多樣性。分離純化TNF-α，并鑒定其活性。以TNF-α為靶標對抗體庫進行7輪的篩選富集，以無關蛋白如HPO、人整合素β3胞外區(qū)蛋白為靶標作ELISA實驗鑒定結合特異性，結果證明篩選到的scFv特異性較好。將其轉化非抑制型大腸桿菌TOP10，IPTG誘導表達，SDS-PAGE和Westemblot檢測表明，單鏈抗體在E.coliTOP10中得到了可溶性表達。然后，我們利用原核表達了單鏈抗體并進行了復性方面上的研究。