SIRT1和PGC-1α在糖尿病大鼠海馬組織中的表達及津力達的干預影響.pdf

1、背景介紹:
　　 糖尿病是一種以血糖增高為特征的多病因代謝疾病。大量的流行病學研究提示，糖尿病已是認知功能障礙的重要危險因素，主要以輕中度的認知功能受損為特征，同時伴有大腦結構、神經功能及神經精神等方面的病理性改變，其具體發(fā)病機制尚不明確。目前研究提示氧化應激在糖尿病中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)是新出現的在抗氧化應激系統(tǒng)中起關鍵作用的轉錄調節(jié)因子，在神經保護中發(fā)揮著

2、重要作用，而沉默調節(jié)蛋白1(SIRT1)則可調節(jié)氧化應激條件下PGC-1α的起始和持續(xù)反應，對PGC-1α生物學效應的發(fā)揮起積極作用，被認為與PGC-1α共同構成了一個神經保護的調節(jié)系統(tǒng)。
　　 糖尿病慢性并發(fā)癥，發(fā)病機制復雜多樣，目前，控制和延緩糖尿病并發(fā)癥，降低死亡率至關重要。然而現代醫(yī)學尚缺乏理想藥物及有效方法，最近，一些中藥制劑在改善糖尿病并發(fā)癥癥狀，增強體質等方面表現出了較好的療效。糖尿病認知功能障礙，在中醫(yī)學上，歸屬

3、于“消渴”病合并呆病、健忘等范疇，病機是臟腑陰虛為本，病位在肺、脾、腎三臟，病久陰虛及陽，則三臟虧虛，功能失調，運化水濕功能減弱，加劇痰濁形成。故治療的重點為健脾益氣，消痰利濕。津力達顆粒以人參、黃精、蒼術、苦參、麥冬、地黃、制何首烏、山茱萸、茯苓、佩蘭、黃連、知母、淫羊藿（炙）丹參為成分，主要功用為益氣養(yǎng)陰、健脾運津，用于氣陰兩虛證，具有治療消渴之功效。由此，我們可以推測，津力達顆?？赡芫哂斜Ｗo糖尿病患者認知功能的作用。
　　

4、 目的:
　　 本實驗擬通過檢測2型糖尿病大鼠腦組織海馬區(qū)SIRT1和PGC-1α表達及氧化應激水平，同時觀察大鼠海馬組織的細胞凋亡及電鏡下超微結構的變化情況，旨在探討SIRT1和PGC-1α在糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。并觀察不同劑量津力達顆粒對2型糖尿病大鼠海馬組織的保護作用，檢測其對SIRT1和PGC-1α表達及組織氧化應激水平的影響，從而為復方中藥制劑津力達顆粒在治療和延緩糖尿病認知功能障礙的臨床應用上提供實驗依據，

5、并探討其可能的機制。
　　 方法:
　　 雄性SD大鼠88只，大鼠適應性飼養(yǎng)2d后隨機分組，正常對照組12只給予普通飼料，其余各組大鼠均予高脂飼料，喂養(yǎng)4周。誘發(fā)出胰島素抵抗模型后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg;正常對照組給予同劑量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。模型驗證:2周后讓大鼠禁食8h后行口服糖耐量試驗，凡0min和120min血糖分別大于7.0 mmol/L和11.0 mmol/L的大鼠，作為2型糖

6、尿病造模成功大鼠。本組造模成功大鼠74只，隨機剔除2只，其余大鼠隨機分為模型組、津力達低劑量組(0.75 g/kg）、津力達中劑量組(1.5 g/kg)、津力達高劑量組(3.0g/kg)、α-硫辛酸組(50mg/kg)、胰島素組（諾和靈N，1.5U/kg），每組12只。除胰島素采用皮下注射外，其他藥物均采用0.5％羥甲基纖維素鈉溶解均勻后灌胃給藥。正常對照組與模型組均用同等體積的羥甲基纖維素鈉灌胃。每日給藥1次，連續(xù)處理2個月。8周后對

7、各組大鼠行morris水迷宮檢測其認知功能，應用RT-PCR技術，western blot方法分別檢測各組海馬組織中PGC-1α mRNA的表達及SIRT1及PGC-1α蛋白的表達，同時檢測超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;并行TUNEL凋亡染色觀察其神經細胞損害情況及透射電鏡檢測其超微結構改變。
　　 結果:
　　 1.各組大鼠一般情況
　　 正常對照組大鼠一般情況良好，精神狀

8、態(tài)佳，活動自如，毛發(fā)光澤，飲食及大小便正常，無死亡;模型組大鼠一般情況較差，精神萎靡，行動遲緩，毛發(fā)雜亂無光，出現多飲、多食、多尿現象。各藥物組此種情況均有不同程度改善。
　　 2.Morris水迷宮測試結果
　　 與正常對照組相比，模型組潛伏期明顯延長(P＜0.05)，各藥物治療組除津力達低劑量組較模型組潛伏期無明顯改善外，其余組潛伏期均有不同程度的縮短(P＜0.05)，其中胰島素組效果最為顯著，與正常對照組比較，無顯

9、著差異(P＞0.05)。其次為α-硫辛酸組及津力達高劑量組，其潛伏期較正常組有所延長(P＜0.05)，但與胰島素組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3.光鏡檢查結果
　　 正常對照組海馬CA1區(qū)神經元排列較規(guī)則、緊密，細胞界限清楚，細胞帶較完整;模型組海馬CA1區(qū)細胞排列散亂，稀疏分布不均勻，神經細胞脫失嚴重，并可觀察到比例較高的顏色棕染的凋亡細胞。各藥物治療組的情況較模型組均有不同程度的改善，其中津力達中

10、、高劑量組、α-硫辛酸組及胰島素組改善顯著。
　　 4.透射電鏡檢查結果
　　 正常對照組細胞核染色質分布較均勻，大部分線粒體結構完整，偶見線粒體嵴破壞;模型組細胞結構欠清晰，細胞核有凝集現象，有較多線粒體結構不完整，線粒體嵴破壞;津力達低劑量組部分細胞核染色質凝集，部分細胞核染色質分布不均勻，大部分線粒體結構完整，少量線粒體嵴破壞。津力達中劑量組部分細胞核染色質聚集，呈塊狀，大部分線粒體結構完整，少量線粒體嵴破壞。津力

11、達高劑量組染色質凝集在細胞核邊緣，分布不均勻，部分線粒體嵴破壞。α-硫辛酸組染色質呈塊狀凝集，凝集的染色質主要分布在細胞核邊緣，部分線粒體嵴破壞。胰島素組部分細胞核染色質分布較均勻，部分細胞核染色質凝集，部分線粒體破壞，胞質內有少量空泡。
　　 5.自由基及抗氧化酶指標檢測結果
　　 與正常對照組相比，模型組超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量明顯降低，丙二醛(MDA)含量增多，各藥物治療組可不同程

12、度的提高組織抗氧化酶的含量，降低MDA含量，其中以胰島素、α-硫辛酸、津力達高劑量組效果顯著。津力達高劑量組能明顯提高海馬組織SOD水平，其效果與α-硫辛酸相媲美(P＜0.05)，但比胰島素略差;對于GSH，津力達高劑量組能明顯增加其水平，其效果比α-硫辛酸、胰島素略差，對于MDA水平，胰島素組效果最為顯著，其次為α-硫辛酸，津力達高劑量組和中劑量組效果相當(P＜0.05)。
　　 6.各組大鼠海馬組織PGC-1αmRNA表達量

13、及PGC-1α、SIRT1蛋白表達量
　　 模型組與正常組相比，其PGC-1α mRNA及SIRT1、PGC-1α蛋白表達量均明顯降低(P＜0.05)，各藥物治療組均能不同程度提高PGC-1α mRNA及SIRT1蛋白的含量(P＜0.05)，其中以胰島素、α-硫辛酸及津力達高劑量組效果最為顯著。而PGC-1α蛋白的表達，與模型組相比較，α-硫辛酸及胰島素能夠明顯提高其蛋白含量，津力達中高劑量組雖有一定程度增高，但差異無統(tǒng)計學意義

14、，不過津力達高劑量組的效果仍明顯優(yōu)于低、中劑量組(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 2型糖尿病可使大鼠出現明顯的認知功能障礙，其海馬組織結構明顯破壞，細胞凋亡嚴重。海馬組織PGC-1α mRNA及其蛋白、SIRT1蛋白的表達量明顯下調，而抗氧化酶SOD、GSH表達降低，MDA水平上調。津力達顆?？筛纳?型糖尿病大鼠的認知功能障礙，并保護其海馬組織，其療效與α-硫辛酸相媲美。津力達的神經保護作用，可能部分是通過調節(jié)SI