高脂飲食對(duì)小鼠PGC-1α基因表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、過氧化物酶體增生物激活受體-γ輔激活子-1α（PGC-1α）是線粒體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，最早作為調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的核受體PPARγ的輔激活因子被發(fā)現(xiàn)，它參與能量代謝調(diào)節(jié)的諸多方面，并與哺乳動(dòng)物的心臟發(fā)育、骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)換及機(jī)體禁食后的肝糖異生調(diào)節(jié)等過程有關(guān)。PGC-1α以特殊的組織模式表達(dá)，在棕色脂肪組織、心、腎、骨骼肌中相對(duì)含量較高。在這些組織中，PGC-1α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受寒冷、饑餓、耐力運(yùn)動(dòng)、感染等刺激調(diào)控，以調(diào)節(jié)線粒體能量代

2、謝、肝糖異生等代謝穩(wěn)態(tài)，適應(yīng)機(jī)體需要。PGC-1α的表達(dá)異?；蚧钚匀毕菖c代謝綜合征、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)。
　　為探討高脂飲食對(duì)PGC-1α表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以及PGC-1α在肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生過程中的作用，本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠，誘導(dǎo)高胰島素血癥和胰島素抵抗的發(fā)生，再通過特異性的PI3K抑制劑 LY294002來阻斷胰島素信號(hào)通路，檢測(cè)PGC-1α基因以及與線粒體合成與功能相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)

3、錄與表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠肝臟和腓腸肌內(nèi)PGC-1α表達(dá)下調(diào)；高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥是PGC-1α及線粒體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)下降和線粒體功能異常的主要原因之一。然后，通過構(gòu)建含有PGC-1α啟動(dòng)子序列的熒光素酶融合表達(dá)載體，并在其基礎(chǔ)上構(gòu)建失活各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)位點(diǎn)的突變型載體，將這些載體轉(zhuǎn)染到小鼠肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞，予以游離脂肪酸、胰島素等環(huán)境因素處理后，檢測(cè)PGC-1α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化，并

4、進(jìn)一步研究傳遞這些環(huán)境變量的信號(hào)通路，以及這些信號(hào)通路之間的相互作用對(duì)PGC-1α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性影響。結(jié)果顯示，PGC-1α基因啟動(dòng)子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性主要依賴于啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)CRE及IRE反應(yīng)元件，其轉(zhuǎn)錄活性受到胰島素和p38 MAPK的共同調(diào)節(jié)；油酸能夠通過p38/CREBP/CRE和p38/MEF2/MEFRE信號(hào)通路刺激PGC-1α的基因轉(zhuǎn)錄；而胰島素通過Akt/FoxO1/IRE信號(hào)通路抑制PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄，且胰島素可能是起主導(dǎo)

5、作用的PGC-1α轉(zhuǎn)錄負(fù)向調(diào)控因子。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，能量攝入過多導(dǎo)致高胰島素血癥，體內(nèi)持續(xù)激活的Akt信號(hào)可能是PGC-1α轉(zhuǎn)錄水平低下、線粒體相關(guān)基因表達(dá)下降和功能異常的主要原因之一。由于線粒體的數(shù)量下降和功能障礙與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，結(jié)果可能為理解胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路，也為臨床上預(yù)防和治療以胰島素抵抗為核心的代謝性疾病提供了新的理論依據(jù)。
　　第一部分高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥導(dǎo)致線粒體功能障礙及胰島素抵

6、抗
　　目的：探討高脂飲食對(duì)小鼠PGC-1α表達(dá)的影響以及高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥與小鼠肝臟和肌肉線粒體功能障礙以及胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)系。方法：給予C57BL/6小鼠高脂飲食，通過建立穩(wěn)態(tài)模型法檢測(cè)胰島素抵抗水平；通過western blot檢測(cè)Akt信號(hào)通路的活化；通過western blot檢測(cè)Tfam、NRF1等線粒體相關(guān)基因的蛋白表達(dá)變化；通過Real-time PCR檢測(cè)PGC-1α等線粒體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化；通過檢測(cè)

7、mtDNA、GSH/GSSG、TG含量了解線粒體功能變化。結(jié)果：高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠的肝臟和肌肉組織PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)降低，Akt磷酸化增強(qiáng)，Tfam、NRF1等線粒體相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，mtDNA合成減少、GSH/GSSG比例下降、TG含量升高，線粒體相關(guān)功能下降；胰島素信號(hào)通路阻斷劑LY294002能夠部分逆轉(zhuǎn)上述變化。結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥可能是導(dǎo)致線粒體相關(guān)基因表達(dá)下降、線粒體功能障礙及胰島素抵抗的主要

8、原因之一。
　　第二部分游離脂肪酸對(duì)小鼠肝細(xì)胞和肌肉細(xì)胞PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和表達(dá)的影響
　　目的：探討游離脂肪酸對(duì)培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞和肌肉細(xì)胞PGC-1α基因表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號(hào)通路。方法：對(duì)培養(yǎng)的1c1c7和 c2c12細(xì)胞給予油酸處理，通過Real-time PCR，Western blot的方法分別在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)OA對(duì)肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞PGC-1a表達(dá)的影響；通過western blot檢測(cè)p

9、38信號(hào)通路的活化；構(gòu)建含有PGC-1α啟動(dòng)子序列的熒光素酶融合表達(dá)載體及其突變型載體，將這些載體轉(zhuǎn)染到小鼠肝細(xì)胞，予以油酸處理后，檢測(cè)PGC-1α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化；通過EMSA和ChIP assay檢測(cè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)通路。結(jié)果：油酸激活了1c1c7和c2c12細(xì)胞中的p38 MAPK磷酸化、上調(diào)了PGC-1α的基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)；失活CRE和IRE位點(diǎn)的PGC-1α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性下降；油酸處理后，1c1c7細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子C

10、REBP與PGC-1α啟動(dòng)子 CRE結(jié)合增強(qiáng)，后者轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，而 p38信號(hào)通路阻斷劑SB203580能夠部分逆轉(zhuǎn)上述變化。結(jié)論:油酸能夠上調(diào)PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；PGC-1α基因啟動(dòng)子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性依賴于啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)CRE及IRE反應(yīng)元件；油酸主要通過p38/CREBP/CRE信號(hào)通路刺激1c1c7細(xì)胞PGC-1α的基因轉(zhuǎn)錄。
　　第三部分Akt與p38 MAPK對(duì)小鼠肌肉細(xì)胞PGC-1α表達(dá)的協(xié)同調(diào)控機(jī)制
　　目

11、的：探討Akt/FoxO1與p38/CREBP信號(hào)通路對(duì)小鼠肌肉細(xì)胞PGC-1α轉(zhuǎn)錄的調(diào)控及其機(jī)制。方法：給予C57BL/6小鼠高脂飲食，通過western blot檢測(cè)p38和Akt信號(hào)通路的活化和PGC-1α的表達(dá)變化；通過予c2c12細(xì)胞轉(zhuǎn)染MKK6的組成性活性突變體MKK6E，刺激p38 MAPK的持續(xù)活化；通過感染重組腺病毒ADA-FoxO1，使轉(zhuǎn)錄因子FoxO1持續(xù)在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)；通過熒光素酶活性檢測(cè)，觀察p38和FoxO1

12、對(duì)PGC-1α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果：高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肌肉細(xì)胞PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)降低，Akt與p38磷酸化增強(qiáng)；p38 MAPK主要通過CREBP/CRE信號(hào)通路促進(jìn)PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄；Akt通過FoxO1/IRE信號(hào)通路抑制PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:PGC-1α基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受Akt和p38 MAPK的共同調(diào)節(jié)；在缺乏轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的作用的情況下，p38/CREBP/CRE信號(hào)通路不足以單獨(dú)激