弓形蟲(chóng)表面抗原P30與免疫佐劑CTA2-B復(fù)合基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)、純化與鑒定.pdf

1、弓形蟲(chóng)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng)，能感染包括人類在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物，引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)呈世界性分布，人群感染率高達(dá)25％～50％。孕婦孕期首次感染，弓形蟲(chóng)可穿越胎盤(pán)屏障感染胎兒，影響其發(fā)育，重者導(dǎo)致畸胎、死胎，存活者也常有畸形及智力發(fā)育不全等嚴(yán)重后遺癥，同時(shí)可使孕婦出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)。健康成人感染弓形蟲(chóng)多為隱性感染，但當(dāng)機(jī)體免疫功能受累時(shí)，如患惡性腫瘤、艾滋病或器官移植等，弓形蟲(chóng)的增殖力和致病力明顯增強(qiáng)，是其致死的重要原因。弓形蟲(chóng)

2、還可引起禽畜疾病，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，無(wú)任何有效的防治方法。疫苗的研究成為預(yù)防與治療弓形蟲(chóng)病的發(fā)展方向。 P30抗原作為弓形蟲(chóng)速殖子表面的主要抗原之一，具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA抗體和CD8+T細(xì)胞殺傷弓形蟲(chóng)，是最有希望的疫苗候選抗原。另外，弓形蟲(chóng)病主要通過(guò)粘膜途徑感染，應(yīng)用無(wú)毒性的霍亂毒素A2/B(CTA2/B)亞基作為免疫佐劑，能有效增強(qiáng)P30蛋白的免疫原性，可以增強(qiáng)免疫

3、作用，打破免疫耐受，是研制高效的弓形蟲(chóng)疫苗的理想佐劑。 國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾用多種表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)P30與CTA2/B蛋白，動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示疫苗的效果不理想。原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，但缺乏真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，表達(dá)產(chǎn)物往往沒(méi)有生物活性，質(zhì)量不高。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖能正確表達(dá)蛋白，但產(chǎn)量低，無(wú)法進(jìn)行P30蛋白下游研究和大規(guī)模動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究選用既具有原核生物的優(yōu)點(diǎn)，又具有真核生物功能的畢赤酵母表達(dá)

4、系統(tǒng)。迄今為止，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功地表達(dá)了400多種蛋白。酵母是單細(xì)胞真核生物，兼有細(xì)菌易培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單、高效表達(dá)外源蛋白等優(yōu)點(diǎn)，又具有真核細(xì)胞的糖基化和二硫鍵形成等加工和修飾作用，是表達(dá)外源蛋白的適宜宿主。本研究使用的酵母表達(dá)載體pGAPZαA是組成型表達(dá)載體，含有引導(dǎo)蛋白出胞的α-信號(hào)肽，可使產(chǎn)物分泌出胞，有利于產(chǎn)品的純化和生產(chǎn)；利用編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的啟動(dòng)子，可組成性表達(dá)外源基因而不需要甲醇誘導(dǎo)；

5、攜帶c-myc表位和多組氨酸尾，具有Zeocin抗性篩選標(biāo)記基因；強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOXl，能高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)水平很高，如破傷風(fēng)毒索蛋白的產(chǎn)量達(dá)12g/L。 本研究采用分子生物學(xué)的方法，擬構(gòu)建含有弓形蟲(chóng)主要表面抗原P30與免疫佐劑CTA2/B復(fù)合基因的克隆載體及酵母表達(dá)載體，并在畢赤酵母中表達(dá)、純化與鑒定。方法：PCR擴(kuò)增復(fù)合基因，TA克隆建立克隆載體pMD18T-p30-CTX；用亞克隆技術(shù)把P30-CTX復(fù)合基因克隆

6、入表達(dá)載體，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGAPZαA-p30-CTX；重組載體分別以PCR、酶切及測(cè)序鑒定；使用生物信息軟件分析P30-CTX復(fù)合基因，預(yù)測(cè)編碼蛋白結(jié)構(gòu)。線性化重組酵母表達(dá)載體，電穿孔法導(dǎo)入畢赤酵母GS115，抗生素Zeocin篩選、PCR法鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；酵母工程菌搖瓶表達(dá)，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblotting分析。結(jié)果：成功構(gòu)建了含目的基因的克隆載體pMD18T-p30-CTX和酵母表達(dá)載體pGAP-p

7、30-CTX。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定正確，測(cè)序結(jié)果證實(shí)為pGAP-p30-CTX基因，序列分析同源性為99.82％，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)P30-CTX蛋白結(jié)構(gòu)折疊無(wú)明顯改變。P30-CTA2/B重組蛋白在畢赤酵菌中成功分泌表達(dá)，產(chǎn)量高達(dá)0.57g/L；SDS-PAGE顯示其在49000處有一條明顯表達(dá)蛋白條帶，WesternBlot結(jié)果顯示表達(dá)蛋白具有P30抗原特異性，并測(cè)定蛋白純度、濃度和產(chǎn)量。結(jié)論意義：大量具有免疫活性的P30-CTA