剛地弓形蟲NT株P(guān)30基因的克隆與表達(dá)及其ELISA檢測方法的建立.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的醫(yī)學(xué)原蟲，能感染幾乎所有恒溫動(dòng)物(包括人類)，引起弓形蟲病。在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊，造成隱性感染；但當(dāng)宿主免疫功能下降時(shí)(如腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，弓形蟲可在宿主體內(nèi)播散引起弓形蟲病甚至導(dǎo)致宿主死亡。弓形蟲感染也是家畜家禽流產(chǎn)、畸胎、死產(chǎn)的主要原因之一，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重。剛地弓形蟲膜表面蛋白1(SAGl)是弓形蟲速殖子期特異性抗原，能夠誘

2、導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA抗體和CD8+T細(xì)胞殺傷弓形蟲。已有研究表明，弓形蟲的主要表面抗原1具有很強(qiáng)的免疫原性，是弓形蟲診斷和疫苗研究的重要候選抗原分子。SAGl抗原在原蟲含量較低，因此用基因工程技術(shù)在體外表達(dá)P30蛋白，然后利用該蛋白作抗原，建立剛地弓形蟲ELISA抗體檢測方法。 本實(shí)驗(yàn)參考Genbank登錄的剛地弓形蟲(Toxoplasma．gondii)P30全基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，通過PCR在剛地弓形蟲的基

3、因組DNA中擴(kuò)增出P30的相應(yīng)片段，然后構(gòu)建T-A克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定后進(jìn)行測序。再亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a(+)/P30并轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，于含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，再經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒pET-32a(+)qP30轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)出分子量為48.3kDa的融合蛋白，經(jīng)Western-blotti

4、ng鑒定目的蛋白具有良好的免疫學(xué)活性，為研究重組蛋白的免疫原性奠定了基礎(chǔ)。 重組T.gondii P30蛋白經(jīng)過鎳柱純化后，作為抗原包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，初步建立了豬弓形蟲抗體的間接ELISA檢測方法。對(duì)ELISA的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明T.gondii P30蛋白抗原的最適包被濃度為2.75μg/ml，最適封閉液為5％脫脂乳，檢測血清稀釋度為1:640，抗原和抗體的作用時(shí)間為1h，HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為