MⅡP抑制子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移及其機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。侵襲、轉(zhuǎn)移是EC患者死亡的主要原因。因此，抑制侵襲轉(zhuǎn)移是提高EC患者生存率的關(guān)鍵。遷移侵襲抑制蛋白（Migration and InvasionInhibitory Protein，MIIP）基因為新發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲抑制基因，定位于1p36，該區(qū)域在包括EC在內(nèi)的多種腫瘤中缺失。MIIP的定位提示其可能在EC的侵襲、轉(zhuǎn)移中

2、發(fā)揮作用，但關(guān)于MIIP與EC的研究，國內(nèi)外尚未見報道。本研究首先檢測MIIP在人正常子宮內(nèi)膜、EC組織中的表達(dá)，若發(fā)現(xiàn)MIIP的缺失與EC轉(zhuǎn)移有關(guān)，則通過體外試驗進(jìn)一步探討MIIP是否可抑制EC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。若MIIP抑制EC細(xì)胞的遷移及侵襲，則進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)及功能學(xué)兩方面探討MIIP抑制EC細(xì)胞遷移及侵襲的機(jī)制。由于肌動蛋白細(xì)胞骨架重組（包括應(yīng)力纖維及板狀偽足）是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，Rho GTPases可調(diào)節(jié)肌動蛋白

3、骨架重組，因此本研究將探討MIIP是否通過Rho GTPases信號傳導(dǎo)通路（包括與應(yīng)力纖維形成有關(guān)的Rho/Rock1信號傳導(dǎo)通路及與板狀偽足形成有關(guān)的Racl/PAK1信號傳導(dǎo)通路）抑制EC細(xì)胞的遷移及侵襲。
　　 一、MIIP蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的研究
　　 目的：探討MIIP在正常子宮內(nèi)膜及EC組織中的表達(dá)水平及其與EC臨床病理特征的關(guān)系。
　　 方法：Westernblot檢測MIIP在正常子

4、宮內(nèi)膜及EC組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：EC組織中MIIP表達(dá)水平顯著低于正常子宮內(nèi)膜。高分化EC患者M(jìn)IIP表達(dá)水平明顯高于中、低分化者；FIGOⅠ+Ⅱ期MIIP表達(dá)水平明顯高于Ⅲ+Ⅳ期患者。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)IIP表達(dá)水平顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。
　　 結(jié)論：MIIP的失表達(dá)可能與EC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。MIIP的失表達(dá)與EC不良病理特征（低分化、晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關(guān)，提示預(yù)后不良。
　　 二、MIIP對子宮

5、內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖以及遷移、侵襲的影響
　　 目的：探討MIIP基因?qū)C細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。
　　 方法：Western blot檢測MIIP在EC細(xì)胞株AN3CA、ECC-1、Ishikawa、HEC1A及HEC1B中的表達(dá)。Si-RNA及Ad-MIIP分別下調(diào)及上調(diào)EC細(xì)胞MIIP表達(dá)。MTT檢測MIIP下調(diào)/上調(diào)后MIIP對EC細(xì)胞增殖的影響，平板克隆形成試驗檢測pcDNA3.1-MIIP及pcDNA3.

6、1-control轉(zhuǎn)染后MIIP對EC細(xì)胞增殖的影響。劃痕損傷實(shí)驗檢測MIIP下調(diào)/上調(diào)對細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell轉(zhuǎn)移、侵襲實(shí)驗檢測MIIP下調(diào)/上調(diào)前后對EC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果：各細(xì)胞株中，HEC1A細(xì)胞MIIP表達(dá)水平相對較高，Si-RNA能使HEC1A細(xì)胞中MIIP表達(dá)水顯著下降；MIIP在AN3CA及HEClB細(xì)胞株中幾乎不可見，Ad-MIIP感染后，AN3CA及HEC1B細(xì)胞中MIIP

7、表達(dá)水平明顯上升。MTT結(jié)果顯示72h內(nèi)，MIIP可抑制EC細(xì)胞的增殖，但與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-control質(zhì)粒組HEC1A及HEC1B細(xì)胞形成克隆數(shù)量多，體積較大，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIIP質(zhì)粒組細(xì)胞形成克隆數(shù)少，體積較小。HEC1A細(xì)胞MIIP下調(diào)后，與對照組相比，劃痕損傷試驗顯示細(xì)胞遷移能力明顯增加，在Transwell遷移培養(yǎng)體系中，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增加；反之，AN3CA及HEClB細(xì)胞MIIP上

8、調(diào)后，與對照組相比，劃痕損傷試驗顯示細(xì)胞遷移能力明顯減低，Transwell遷移實(shí)驗顯示穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減低。同時，用Transwell侵襲培養(yǎng)體系，也得到了與Transwell遷移培養(yǎng)體系相似的結(jié)果，即HEC1A細(xì)胞MIIP下調(diào)后，穿膜細(xì)胞數(shù)也較對照組明顯增加；HEC1B細(xì)胞MIIP上調(diào)后，穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減低。
　　 結(jié)論：MIIP可抑制EC細(xì)胞的增殖。MIIP高表達(dá)的HEC1A細(xì)胞中的MIIP被下調(diào)后，細(xì)胞遷移、侵襲能

9、力明顯增加；MIIP低表達(dá)的HEC1B，AN3CA細(xì)胞在上調(diào)MIIP表達(dá)后，遷移、侵襲能力明顯下降。因此，MIIP基因可抑制EC細(xì)胞的遷移、侵襲。
　　 三、MIIP通過阻滯Rho/Rock1信號傳導(dǎo)通路抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移
　　 目的：探討MIIP是否通過阻滯Rho/Rock1信號傳導(dǎo)通路而影響應(yīng)力纖維的形成，進(jìn)而抑制EC細(xì)胞遷移、侵襲。
　　 方法：F-actin免疫熒光染色觀察MIIP上調(diào)/下調(diào)前后細(xì)胞形

10、態(tài)改變。GTPRho pulldown試驗檢測MIIP對Rho活性的影響。免疫共沉淀檢測MIIP是否可與Rho下游作用因子Rock1結(jié)合。HEC1B細(xì)胞共轉(zhuǎn)染CA-RhoA-GFP+MIIP/pDsRed（實(shí)驗組）或CA-RhoA-GFP+pDsRed（對照組），檢測MIIP對RhoA定位及功能的影響。
　　 結(jié)果： MIIP上調(diào)使細(xì)胞內(nèi)中心應(yīng)力纖維明顯減少，且大部分應(yīng)力纖維位于細(xì)胞邊緣區(qū)域。反之，MIIP下調(diào)可使中心應(yīng)力纖維較

11、對照組明顯增多。MIIP上調(diào)可使沉淀下來的活性形式的RhoA明顯減低：MIIP下調(diào)可使沉淀下來的活性形式的RhoA明顯升高。免疫共沉淀顯示MIIP可與Rho下游作用因子Rock1結(jié)合。HEC1B細(xì)胞共轉(zhuǎn)染后：對照組細(xì)胞顯示腫瘤細(xì)胞遷移的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞尾部收縮，RhoA聚集于細(xì)胞尾部；然而MIIP的存在抑制了RhoA的功能，使尾部無法收縮而明顯延長，從而抑制了細(xì)胞的遷移。
　　 結(jié)論：MIIP在形態(tài)上可抑制應(yīng)力纖維的形成，使細(xì)胞

12、尾部無法收縮，從而抑制了EC細(xì)胞的遷移。MIIP在功能上可能通過與RhoA競爭性結(jié)合其下游作用因子Rock1，阻滯了Rho信號傳導(dǎo)通路而抑制應(yīng)力纖維形成。
　　 四、MIIP通過阻滯Rac1/PAK1信號傳導(dǎo)通路抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移
　　 目的：探討MIIP是否通過阻滯Rac1/PAk1信號傳導(dǎo)通路而影響與細(xì)胞遷移有關(guān)的板狀偽足的形成，進(jìn)而抑制EC細(xì)胞遷移、侵襲。
　　 方法：F-actin免疫熒光染色觀察MI

13、IP上調(diào)/下調(diào)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。GTPRac pulldown方法檢測MIIP對Rac活性的影響。免疫共沉淀檢測MIIP是否可與Racl下游作用因子PAK1結(jié)合。Rac1免疫熒光染色檢測MIIP對Rac1在細(xì)胞中定位的影響（Ad-vector為對照組，Ad-MIIP為實(shí)驗組）。
　　 結(jié)果：MIIP上調(diào)使板狀偽足較對照組明顯減少；MIIP下調(diào)使板狀偽足較對照組明顯增多。MIIP上調(diào)可使沉淀下來的活性形式的Rac1明顯減低；MI

14、IP下調(diào)可使沉淀下來的活性形式的Rac1明顯升高。免疫共沉淀顯示MIIP可與Rac1下游作用因子PAK1結(jié)合。HEC1B細(xì)胞MIIP上調(diào)后，Rac1聚集于細(xì)胞與細(xì)胞之間，而對照組Rac1位于移動細(xì)胞前緣促進(jìn)細(xì)胞遷移。
　　 結(jié)論：MIIP在形態(tài)上可抑制細(xì)胞前緣板狀偽足的形成，減少細(xì)胞遷移的驅(qū)動力，從而抑制EC細(xì)胞的遷移。其機(jī)制可能是MIIP通過與Rac1競爭性結(jié)合其下游作用因子PAK1，阻滯了Rac1信號傳導(dǎo)通路而抑制板狀偽足的