自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)全層皮膚創(chuàng)面愈合的研究.pdf

1、第一章，目的：建立體外分離、純化并擴(kuò)增成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法。分析所培養(yǎng)細(xì)胞的表面抗原并檢測(cè)它們向脂肪細(xì)胞分化的潛能。 方法：從大鼠脛骨下端抽取骨髓，以貼壁培養(yǎng)法分離、純化和擴(kuò)增大鼠BMSCs。用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)所培養(yǎng)的第2代細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原以及它們的細(xì)胞周期特征。對(duì)用成脂培養(yǎng)液培養(yǎng)10天和21天的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，觀察胞質(zhì)內(nèi)脂滴沉積情況。 結(jié)果：所培

2、養(yǎng)之細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣，原代細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)。第2代細(xì)胞的表面抗原CD29和CD90為陽性，造血細(xì)胞譜系抗原CD45為陰性。約有90％的細(xì)胞處于G0/G1期。在成脂誘導(dǎo)后第10天和第21天，鏡下可見分別約有40％和90％的細(xì)胞內(nèi)積聚了可被油紅O染液著色的脂滴，證實(shí)這些細(xì)胞發(fā)生了成脂分化。 結(jié)論：本研究成功地體外分離、純化和擴(kuò)增了大鼠BMSCs。這些擴(kuò)增后的第二代細(xì)胞表達(dá)BMSCs表面抗原，具有良好的增殖及向脂肪細(xì)胞分化的潛能。

3、 第二章：嵌合性5型腺病毒載體Ad5/F35體外轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究 目的：研究攜帶35型腺病毒纖毛的嵌合性5型腺病毒載體Ad5/F35能否有效地將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并觀察eGFP基因在大鼠BMSCs內(nèi)持續(xù)表達(dá)的時(shí)間；觀察被轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs是否保留其成脂分化的潛能。 方法：貼壁培養(yǎng)法分離、擴(kuò)增大鼠BMSCs。用帶有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-e

4、GFP)分別以1、10、100、1000的感染復(fù)數(shù)(M01)轉(zhuǎn)染第2代大鼠BMSCs；熒光倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)eGFP基因的轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)水平，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以評(píng)估病毒對(duì)大鼠BMSCs基本生物學(xué)特性的影響；對(duì)MOI=100的病毒轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs在轉(zhuǎn)染后第2、7、14、21、30天分別用FCM檢測(cè)大鼠BMSCs內(nèi)eGFP的表達(dá)情況；對(duì)MOI=100的病毒轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs在轉(zhuǎn)染后第2天用成脂培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞15天，對(duì)

5、誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，觀察被轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs內(nèi)脂滴沉積情況。 結(jié)果：MOI在1到1000范圍內(nèi)，eGFP基因轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平與Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向劑量相關(guān)性。MOI=100的病毒可轉(zhuǎn)染90％左右的大鼠BMSCs，且轉(zhuǎn)基因在一個(gè)月內(nèi)均有表達(dá)。MOI為1、10、100的病毒不影響大鼠BMSCs的活力和增殖能力。轉(zhuǎn)染后大鼠BMSCs在成脂培養(yǎng)液中培養(yǎng)第15天，可見eGFP陽性細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)含有能夠被油紅O著色

6、的脂滴。 結(jié)論：在不影響細(xì)胞活力和增殖能力的同時(shí)，嵌合性5型腺病毒載體Ad5/F35可以高效地將eGFP基因體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，轉(zhuǎn)基因能夠在大鼠BMSCs中表達(dá)。被轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs依然保留其成脂分化的潛能。本研究為使用BMSCs進(jìn)行細(xì)胞治療與基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第三章，目的：研究自體BMSCs局部注射移植能否促進(jìn)全層皮膚創(chuàng)面的愈合，提高創(chuàng)面愈合的質(zhì)量，并觀察植入的自體BMSCs在體內(nèi)的存活情況及其與創(chuàng)面肉芽

7、組織形成的關(guān)聯(lián)性。 方法：分離、擴(kuò)增大鼠BMSCs。在大鼠背部制作三個(gè)圓形全層皮膚創(chuàng)面。我們?cè)诩?xì)胞移植組的創(chuàng)面邊緣注射含第二代自體大鼠BMSCs細(xì)胞懸液，在生理鹽水組的創(chuàng)面邊緣注射生理鹽水，對(duì)曠置組的創(chuàng)面不做任何處理。在細(xì)胞移植后第1、3、6、9、12和15天觀察各組創(chuàng)面愈合的大體情況，并比較前4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面面積的大小。在細(xì)胞移植后第15天獲取各組創(chuàng)面肉芽組織制作組織切片，觀察它們組織學(xué)形態(tài)特點(diǎn)。在我們用MOI=100的Ad

8、5/F35-eGFP體外轉(zhuǎn)染第2代大鼠BMSCs第二天，將25μl含有約5×10<'5>個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(BMSCs-eGFP)的細(xì)胞懸液注射在細(xì)胞移植組創(chuàng)面邊緣，同時(shí)將25μl生理鹽水注射在生理鹽水組創(chuàng)面邊緣作為對(duì)照。分別于BMSCs-eGFP移植后第7和14天獲取細(xì)胞移植部位皮膚樣本，于第14天獲取創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織樣本，制作冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察BMSCs-eGFP在原有組織和新生組織內(nèi)的存活、分布和形態(tài)。 結(jié)果：在自體BMSC

9、s移植后大體上觀，細(xì)胞移植組創(chuàng)面愈合速度快于其余兩組創(chuàng)面。在細(xì)胞移植后第1天各組創(chuàng)面面積無顯著性差異，在細(xì)胞移植后第3、6、9天細(xì)胞移植組創(chuàng)面面積小于其它兩組創(chuàng)面面積。在細(xì)胞移植第15天，鏡下可見細(xì)胞移植組創(chuàng)面肉芽組織成熟和再上皮化程度均高于其余兩組創(chuàng)面。在BMSCs-eGFP移植后第7和14天能夠在細(xì)胞移植部位真皮內(nèi)發(fā)現(xiàn)BMSCs-eGFP。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植后第14天可見少量的BMSCs-eGFP出現(xiàn)在細(xì)胞移植創(chuàng)面肉芽組織淺層。