間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我增殖能力和分化潛能的細(xì)胞，在特定的條件下可以分化為不同的功能細(xì)胞，甚至形成多種組織和器官。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因其具有多向分化潛能，取材方便，增殖能力強(qiáng)，易于在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增等特點(diǎn)，成為理想的組織工程種子細(xì)胞，在促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)中具有較大科研價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。針對目前異體肝移植存在供肝嚴(yán)重不足，手術(shù)及維持費(fèi)用昂貴，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，以及移植由于免疫排斥的發(fā)生而導(dǎo)致供肝功能喪失等缺點(diǎn)，人們期望通過利用MSCs治療來

2、解決肝移植帶來的這些問題。但目前文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)MSCs在體內(nèi)能否分化為肝細(xì)胞仍存在很大爭議，另外，目前研究和應(yīng)用多采用體外分離培養(yǎng)的MSCs或經(jīng)誘導(dǎo)后的MSCs經(jīng)門靜脈、脾靜脈、肝內(nèi)等途徑移植，但這類方法所移植的細(xì)胞因?yàn)轶w內(nèi)外環(huán)境的差異，其生物學(xué)性狀、行為往往發(fā)生改變，因此尋求更有效安全的利用MSCs的方法成為目前研究的一個(gè)重點(diǎn)。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠10Gy全身照射后，經(jīng)尾靜脈移植的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(包括MSC和HSC)能夠

3、定植在外周血、骨髓、腸道、肝臟、脾臟、骨骼肌、腦等多種組織。在此基礎(chǔ)上，本研究以GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞建立骨髓嵌合小鼠模型，并觀察了骨髓單個(gè)核細(xì)胞在肝內(nèi)的分化，為了進(jìn)一步明確MSCs在體內(nèi)能否分化為肝細(xì)胞，我們以丙烯醇致肝損傷進(jìn)行MSCs肝局部移植，以觀察外源性移植的MSCs在肝內(nèi)的分化。GFP基因是一種標(biāo)記基因，該基因表達(dá)后產(chǎn)生的綠色熒光蛋白在紫外光的激發(fā)下可發(fā)出明亮的綠光，因此利用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的MSCs能夠方便直觀的追蹤

4、觀察MSCs在體內(nèi)的分化。 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果提示，我們考慮能否利用干細(xì)胞動(dòng)員這一體內(nèi)方法促進(jìn)肝損傷修復(fù)，因此我們培養(yǎng)、鑒定經(jīng)G-CSF動(dòng)員后大鼠外周血MSCs，此基礎(chǔ)上我們觀察了肝損傷后肝內(nèi)與干細(xì)胞遷移動(dòng)員相關(guān)的信號分子SDF-1的表達(dá)變化，探討外周血MSCs如何遷移到肝臟，并檢測其向肝細(xì)胞分化的能力，為利用MSCs動(dòng)員促進(jìn)肝損傷修復(fù)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。主要結(jié)果和結(jié)論： 1．10Gy <'60>Co

5、γ射線照射的小鼠移植GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞后，造血重建，小鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)恢復(fù)，明顯提高照射后小鼠的存活率，移植小鼠至今已存活16個(gè)月。 2．骨髓嵌合小鼠模型肝內(nèi)觀察到移植來源的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與周圍肝細(xì)胞相似，免疫熒光雙染結(jié)果顯示此類細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)GFP和白蛋白，說明移植的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在小鼠肝內(nèi)能分化為具有分泌白蛋白功能的肝細(xì)胞。經(jīng)局部移植的MSCs能夠定植在肝臟，免疫熒光雙染結(jié)果顯示此類細(xì)胞能夠

6、同時(shí)表達(dá)GFP和白蛋白，說明移植的MSCs在小鼠肝內(nèi)能分化為具有分泌白蛋白功能的肝細(xì)胞。 3．骨髓嵌合小鼠模型肝內(nèi)還觀察到竇間隙內(nèi)有多量的呈成纖維細(xì)胞樣和內(nèi)皮細(xì)胞樣的GFP陽性細(xì)胞，這類細(xì)胞有可能是肝卵圓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，提示我們骨髓單個(gè)核細(xì)胞在肝內(nèi)的分化是幾種途徑并存。 4．經(jīng)20μg/Kg G-CSF動(dòng)員后外周血MSCs集落數(shù)量明顯高于未動(dòng)員組和10μg/Kg動(dòng)員組，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和干細(xì)胞標(biāo)志物檢測證實(shí)

7、利用G-CSF動(dòng)員能夠明顯的提高外周血MSCs數(shù)量。 5．肝損傷后肝組織內(nèi)SDF-1mRNA和蛋白表達(dá)在傷后5d內(nèi)持續(xù)升高，目前研究表明SDF-1與干細(xì)胞動(dòng)員有密切關(guān)系，推測傷后肝內(nèi)SDF-1表達(dá)上調(diào)，能夠吸引外周血中MSCs歸巢到肝臟參與損傷修復(fù)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。HGF+FGF-4和肝勻漿蛋白都能誘導(dǎo)外周血培養(yǎng)的MSCs分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。說明外周血內(nèi)的MSCs具有分化為肝細(xì)胞，參與肝臟損傷修復(fù)的潛能。 6．