不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：終末期肝病嚴(yán)重危害人類健康，肝移植被認(rèn)為是治療終末期肝病最有效的方法，但因肝源、費(fèi)用及抗排斥藥物的不良反應(yīng)等問題受到限制。干細(xì)胞移植治療終末期肝病作為一種新方法顯示出良好的應(yīng)用前景。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有極強(qiáng)的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，且低免疫源性，有望成為治療終末期肝病的一種新型種子細(xì)胞。目前實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為BMSCs參與受損肝組織的修復(fù)，但機(jī)制尚不明確，是否為多數(shù)研究者認(rèn)為的干細(xì)胞跨胚層分化?目前國內(nèi)外已有

2、研究將干細(xì)胞移植治療終末期肝病應(yīng)用于臨床，獲得了一定療效，但目前移植效率的問題，如移植途徑是否影響移植效率，目前尚不清楚。因此本課題基上述兩個(gè)問題，將采用體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)明確BMSCs是否可向肝樣細(xì)胞分化，為體內(nèi)干細(xì)胞移植治療肝病終末期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。借助動(dòng)物模型經(jīng)門靜脈、外周靜脈移植BMSCs，分析其定植情況及對肝功能的影響，明確兩途徑對干細(xì)胞治療肝病療效的影響，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：(1)本研究采用密度梯度離心法和

3、貼壁細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)傳代獲得純化的BMSCs。(2)將純化后的BMSCs在肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor HGF)和成纖維生長因子-4(basic fibroblast factor FGF-4)的作用下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測肝細(xì)胞表面標(biāo)志物白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18的表達(dá)，明確BMSCs是否可分化為肝樣細(xì)胞。(3)將CCl4輪替注射大鼠四肢內(nèi)側(cè)皮下，建造肝硬化大鼠

4、模型。將GFP標(biāo)記后的BMSCs經(jīng)外周靜脈、門靜脈移植入肝硬化模型大鼠體內(nèi)，熒光顯微鏡檢測干細(xì)胞在肝內(nèi)的定植情況，檢測血清肝功能及免疫組化檢測肝組織白蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)采用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)法分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度高，體外培養(yǎng)增殖能力活躍。(2)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)HGF和FGF-4共誘導(dǎo)培養(yǎng)共28天，分別在14天、21天、28天免疫細(xì)胞化學(xué)檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，白蛋白及角蛋白

5、18表達(dá)陽性率逐漸增加，甲胎蛋白表達(dá)逐漸降低。未誘導(dǎo)組白蛋白、角蛋白、甲胎蛋白表達(dá)陰性。(3)HE及Masson染色顯示肝硬化大鼠模型建立成功。體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達(dá)。經(jīng)門靜脈及外周靜脈移植BMSCs28天后，兩移植組大鼠肝臟組織切片均可見散在的綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞，表明BMSCs移植后能定植于肝硬化大鼠模型體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組各肝功能指標(biāo)ALB、ALT、AST均隨時(shí)

6、間變化逐漸好轉(zhuǎn)，門靜脈實(shí)驗(yàn)組與其對照組比較各肝功能指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尾靜脈實(shí)驗(yàn)組與其對照組比較各肝功能指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩實(shí)驗(yàn)組之間比較各肝功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化檢測肝組織白蛋白表達(dá)，門靜脈實(shí)驗(yàn)組與其對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尾靜脈實(shí)驗(yàn)組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩實(shí)驗(yàn)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可分化成為肝樣細(xì)胞；
　　 2．經(jīng)尾靜