骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與移植物動(dòng)脈硬化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：移植物動(dòng)脈硬化是各種器官移植物發(fā)生慢性移植物失功的共同病理變化。移植物動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生所致管腔狹窄，引起移植器官的血供不足和纖維化，被認(rèn)為是移植物功能進(jìn)行性惡化的首要原因。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞是受體起源，95%以上是平滑肌細(xì)胞，多種細(xì)胞可以參與新生內(nèi)膜的增生并分化成平滑肌細(xì)胞。在不同的模型中顯示，骨髓細(xì)胞是否參與血管新生內(nèi)膜增生與中膜平滑肌損傷程度有關(guān)，只有在嚴(yán)重?fù)p傷的情況下，骨髓細(xì)胞才被動(dòng)員參與血管修復(fù)、新生內(nèi)膜增

2、生。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，能夠參與各種損傷組織的修復(fù)。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外能夠分化成為平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，是否參與移植物動(dòng)脈硬化目前尚不清楚，因此研究間充質(zhì)干細(xì)胞是否參與移植物動(dòng)脈硬化，誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞大量凋亡能否促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞參與移植物動(dòng)脈硬化，對(duì)進(jìn)一步闡明移植物動(dòng)脈硬化的發(fā)病機(jī)制及提供有效的防治策略具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
　　 目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP

3、的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否參與移植物動(dòng)脈硬化，構(gòu)建組織特異性SM22α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)P53基因慢病毒載體，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖和遷移的影響，體內(nèi)參與移植物動(dòng)脈硬化的影響，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與移植物動(dòng)脈的機(jī)制。
　　 方法：采用常規(guī)血管環(huán)貼壁法、酶消化法，改良血管環(huán)貼壁法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，有限稀釋法純化內(nèi)皮細(xì)胞，采用組織塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。PCR擴(kuò)增組織特異性的SM22

4、α啟動(dòng)子，構(gòu)建以此為啟動(dòng)子的慢病毒載體，體外感染大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；原代培養(yǎng)并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志,體外誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定，將攜帶EGFP的慢病毒載體體外感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMMSC-EGFP；建立大鼠主動(dòng)脈移植模型，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從尾靜脈輸入受體大鼠體內(nèi)，組織學(xué)檢查判定移植物動(dòng)脈硬化，在熒光顯微鏡下觀察移植物中表達(dá)EGFP的細(xì)胞；構(gòu)建SM22α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的P5

5、3慢病毒載體，體外感染平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，Hoechst 33258 染色和Annextin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀測(cè)定平滑肌細(xì)胞的凋亡，收集并濃縮細(xì)胞凋亡上清，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞凋亡上清對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖作用，Transwell 小室法測(cè)定凋亡上清對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化遷移的影響；SM22α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的P53 慢病毒載體離體感染主動(dòng)脈移植物，TUNEL 測(cè)定中膜平滑肌細(xì)胞的凋亡，熒光顯微鏡觀察移植物中表達(dá)EGFP的細(xì)胞。

6、r>　　 結(jié)果：改良血管環(huán)貼壁法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的效果最佳，并以此采用有限稀釋法純化得到無(wú)雜細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞，組織塊法適合動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
　　 PCR 擴(kuò)增的SM22α啟動(dòng)子經(jīng)測(cè)序鑒定符合要求，成功構(gòu)建了以此為啟動(dòng)子的慢病毒載體，體外能夠特異驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。全骨髓貼壁法得到的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志均證實(shí)是高純度骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外能夠分化成脂

7、肪、血管平滑肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞，pH穩(wěn)定的培養(yǎng)基對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)是必須的。慢病毒能夠高效感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，凝聚胺能夠提高感染效率，感染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)EGFP。移植物主動(dòng)脈發(fā)生典型的移植物動(dòng)脈硬化病變，在熒光顯微鏡下觀察到表達(dá)EGFP的細(xì)胞成多層聚集于新生內(nèi)膜靠近管腔處；成功構(gòu)建SM22α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的P53 慢病毒載體，體外感染動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在凋亡刺激劑存在的條件下能夠誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞凋亡上清對(duì)骨髓間充