基于生物技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的雷公藤紅素及其類似物抗癌機制研究.pdf

1、雷公藤紅素（celastrol）是從中藥雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）中提取的活性成分，具有廣泛的藥理作用，有望被開發(fā)成治療慢性炎癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥的新藥。當(dāng)前集中某一通路的研究模式雖然發(fā)現(xiàn)了雷公藤紅素影響了體內(nèi)多種信號通路，然而對其缺乏整體的系統(tǒng)性研究，其藥靶和確切的作用機制尚不明確。此外，由于其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、溶解性差、生物利用度差等問題，限制了其臨床應(yīng)用前景，有必要對其進行

2、相應(yīng)地結(jié)構(gòu)改造，以期得到增效減毒的結(jié)構(gòu)改造物。本課題利用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的細胞代謝組學(xué)系統(tǒng)研究了雷公藤紅素及其結(jié)構(gòu)改造物NST-001抗人子宮頸癌細胞的藥理效應(yīng)和作用機制，并對相關(guān)的藥理作用機制理論提出了細胞代謝層面的解釋。探尋和確立藥物作用的靶點是新藥研究中最為關(guān)鍵的一步，本課題利用新穎的藥物靶點篩選模式“基于藥物親和的靶點穩(wěn)定性篩選技術(shù)”（Drug Affinity Responsive Target Stability，

3、DARTS）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）篩選得到了NST-001的潛在靶點——脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)，并通過分子對接技術(shù)構(gòu)建了雷公藤紅素及NST-001與脂肪酸合成酶的對接模擬，間接地驗證了脂肪酸合成酶為N

4、ST-001的靶點。
　　 一、細胞凋亡檢測及基于GC-MS技術(shù)的細胞代謝組學(xué)研究雷公藤紅素抗癌機制
　　 首先通過生物學(xué)技術(shù)手段證明了雷公藤紅素呈現(xiàn)劑量依賴性抑制HeLa細胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，能夠激活HeLa細胞的caspase-3活性，降低細胞線粒體膜電位。選擇三種藥理機制明確的細胞毒性藥物順鉑、多柔比星、紫杉醇作為陽性藥物，利用基于GC-MS的細胞代謝組學(xué)，多通路全方面監(jiān)控HeLa細胞經(jīng)雷公藤紅素處理后代謝特征

5、譜的變化規(guī)律。最終結(jié)果顯示，HeLa細胞三羧酸循環(huán)水平下降，糖酵解上升，能量代謝減緩，氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成、核酸代謝相應(yīng)地受到阻滯，顯示出HeLa細胞處于凋亡的非正常生理狀態(tài)。本研究為雷公藤紅素的半胱氨酸邁克爾加成反應(yīng)作用機制假說提供了代謝組學(xué)層面的佐證。
　　 二、細胞凋亡檢測及細胞代謝組學(xué)研究雷公藤紅素類似物NST-001抗癌機制
　　 首先通過生物學(xué)技術(shù)手段證明了NST-001保持了雷公藤紅素相似的抗癌活性，能以

6、劑量依賴性抑制HeLa細胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，并將HeLa細胞周期阻滯在G2期，能夠激活HeLa細胞的caspase-3、caSpaSe-9活性，降低細胞線粒體膜電位，上調(diào)促凋亡因子Bax的表達，下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2的表達。此后，利用前期建立好的細胞代謝組學(xué)方法系統(tǒng)地研究了NST-001的抗癌機制，結(jié)果顯示，經(jīng)NST-001處理后，HeLa細胞三羧酸循環(huán)水平下降，糖酵解上升，能量代謝減緩，氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成、核酸代謝相應(yīng)地受到

7、阻滯，反映出HeLa細胞處于凋亡的非正常生理狀態(tài)。
　　 三、基于DARTS和MALDI-TOF/TOF MS聯(lián)用的NST-001藥靶研究
　　 藥物靶點的篩選和確證是新藥研究中的重點和難點，闡明了分子靶點可以清晰徹底地闡明藥物的藥理活性和作用機制。雖然關(guān)于雷公藤紅素的大量研究揭示了雷公藤紅素參與和調(diào)節(jié)了體內(nèi)各種信號通路，然而其直接的作用靶點尚未見報道。本課題通過DARTS藥靶篩選方法篩選NST-001直接靶點，并通過M

8、ALDI-TOF/TOFMS進行了鑒定，得到了NST-001的潛在靶點FAS。FAS在多種類型的癌細胞中都處于高表達水平，以FAS為藥靶開發(fā)FAS抑制劑可以用作抗癌、抗肥胖藥物。美國FDA批準(zhǔn)的FAS抑制劑奧利司他(Orlistat)可以通過與FAS中得硫脂酶功能區(qū)域(TE)發(fā)生作用來發(fā)揮其抗癌活性作用。因此利用分子對接技術(shù)將雷公藤紅素及NST-001與FAS中的TE功能區(qū)域進行模擬對接，結(jié)果顯示，NST-001與雷公藤紅素相比，與TE

9、功能區(qū)域作用力更強，提示NST-001可能是比雷公藤紅素更好的FAS抑制劑。
　　 本課題研究借鑒系統(tǒng)生物學(xué)研究策略，綜合運用生物技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究中藥活性單體藥理活性和作用機制，為研究中藥活性單體提供了重要的方法參考。本課題研究建立了一套準(zhǔn)確耐用、快速便捷基于GC-MS的細胞代謝組學(xué)方法;并利用確證的細胞代謝組學(xué)方法系統(tǒng)評價了雷公藤紅素及其結(jié)構(gòu)改造物NST-001的抗癌活性，為雷公藤紅素與半胱氨酸發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)的作用機