慢性應激與波動性高糖誘導的大鼠胰島及INS-1細胞葡萄糖毒性.pdf

1、研究目的 胰島β細胞功能紊亂和外周組織胰島素抵抗是糖尿病發(fā)病機制中的兩個重要方面。糖尿病患者體內的長期高血糖狀態(tài)可導致胰島β細胞合成及分泌胰島素功能受損，甚至誘導β細胞死亡，這被稱之為“胰島β細胞葡萄糖毒性”。糖尿病時的血糖紊亂主要有兩種主要形式，即持續(xù)性高血糖和波動性高血糖。許多體內及體外研究已經表明長期持續(xù)性高糖可造成胰島β細胞的胰島素合成、分泌及基因表達受損，以及細胞死亡。但是，目前關于波動性高糖對胰島β細胞功能毒性效應的

2、研究尚屬少見。盡管在健康個體其體內的血糖水平在生理情況下也存在和輕微的波動，但是流行病學調查發(fā)現在亞臨床期和臨床期的糖尿病患者體內的血糖波動的幅度和頻率較正常個體更為顯著。而且流行病學調查資料顯示血糖變異性是糖尿病患者死亡及血管并發(fā)癥的獨立危險因素。有研究發(fā)現同對照組比較波動性高糖孵育可顯著降低鼠胰島β細胞系INS-1細胞的胰島素分泌、胰島素含量及其基因表達。而且將體外分離的人類胰島孵育于波動性波動高糖中，其葡萄糖刺激的胰島素分泌功能明

3、顯受損，甚至誘導胰島β細胞發(fā)生凋亡。但是波動性高糖造成胰島β細胞毒性影響的可能潛在機制目前尚知之甚少。隨著對胰島β細胞葡萄糖毒性研究的不斷深入，有越來越多不同的機制和通路被證實與長期高糖損傷胰島β細胞功能有著密切的關聯，其中內質網應激和氧化應激是目前此領域中的研究熱點之一。 內質網是胰島β細胞中的一個非常重要的細胞器，在多種細胞生物功能中發(fā)揮著作用，例如胰島素原的合成，翻譯后的折疊修飾，維持細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)等。許多生理性或生化性

4、刺激可導致內質網功能紊亂，誘導內質網應激。胰島β細胞含有豐富的內質網系統，易受到內質網應激的損傷。在生理情況下，適度的內質網應激可參與調節(jié)胰島β細胞合成及分泌胰島素，保持體內的血糖穩(wěn)態(tài)。但是長期高糖環(huán)境可誘導過度的和(或)長時間的內質網應激，產生毒性效應，導致胰島β細胞功能紊亂。例如內質網應激反應中的胰腺內質網應激激酶.真核細胞翻譯起始因子2α(PERK-eIF2α)通路過度活化可通過誘導其下游因子如活化轉錄因子4(ATF4)和C/EB

5、P同源蛋白(CHOP)表達，從而導致胰島β細胞功能受損及凋亡。此外，研究亦發(fā)現大鼠胰島β細胞胰島素含量和基因表達降低與內質網應激反應中另一條通路--肌醇需要酶(IRE1)信號分支過度激活密切相關。但是在波動性高糖狀態(tài)下，胰島β細胞中的內質網應激反應是否也被過度激活，進而惡化胰島β細胞功能損傷，關于此類研究目前尚屬少見。此外，胰島β細胞中由于相對缺乏抗氧化酶，故對氧化應激亦十分敏感?，F認為氧化應激是導致胰島β細胞葡萄糖毒性發(fā)生發(fā)展中的一個

6、重要機制。體內及體外研究證實長期血糖升高可顯著增加胰島β細胞中的活性氧簇(ROS)的生成，升高氧化應激因子如丙二醛(MDA)、硝基酪氨酸、8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)等水平。ROS可通過影響胰腺十二指腸同源盒-1(PDX-1)基因表達及活性，誘導解偶聯蛋白2(UCP-2)表達，介導細胞凋亡等多種途徑最終導致了胰島β細胞功能受損。然而，波動性高糖是否也可明顯誘導胰島β細胞中氧化應激，造成胰島β細胞功能紊亂，關于此類研究報道目前較少見

7、。 因而，為探討波動性高糖對胰島β細胞功能的毒性效應以及可能性機制，本就采用大鼠胰島及β細胞系INS-1細胞，將其孵育在波動性高糖環(huán)境中72h，隨即觀察大鼠胰島及INS-1細胞的胰島素合成及分泌功能變化，以及細胞內氧化應激與內質網應激標志物水平的改變，如eIF2α、PERK、.ATF4、CHOP、ROS、8-OHdG以及硝基酪氨酸等。 研究方法 采用Ficoll-400梯度離心法在體外分離SD大鼠的胰島。將分離的

8、大鼠胰島及INS-1細胞隨機分為3組并孵育在含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中，即11.1mmol/l葡萄糖(對照組)；25.0mmol/l葡萄糖(持續(xù)高糖組)；11.1和25.0mmol/l葡萄糖(交替孵育，波動性高糖組)，共72小時。隨即應用放射免疫學方法檢測大鼠胰島及INS-1細胞的胰島素釋放功能及細胞內胰島素含量。采用實時定量PCR分析方法測定胰島和INS-1細胞中insulin和PDX-1基因表達，以及內質網應激指標如ATF4和CHO

9、P基因表達。Western Blot方法被用于檢測細胞內內質網應激因子eIF2α和PERK蛋白的磷酸化水平。此外，細胞內ROS水平以及氧化應激水平的指標如8-OHdG和硝基酪氨酸的含量也被測定。最后，采用MTT分析方法評價了大鼠胰島和INS-1細胞的細胞活性。 結論：及意義 綜上所述，本研究結果表明同持續(xù)性高糖相比，波動性高糖更容易造成嚴重的大鼠胰島和INS-1細胞的葡萄糖刺激胰島素分泌功能損傷，而且此毒性效應是時間依賴

10、性的。此外波動性高糖可導致胰島素含量、insulin及PDX-1基因表達以及細胞活性的降低。上述的胰島β細胞功能損傷可能與波動性高糖導致的過度內質網應激和氧化應激密切相關。 目前，對于胰島β細胞葡萄糖毒性的概念一般被限定于長期持續(xù)性高糖所造成的胰島β細胞功能損傷及細胞死亡。本研究發(fā)現波動性高糖亦可損傷胰島β細胞合成及分泌胰島素功能，甚至較持續(xù)性高糖更為嚴重。這有助于對胰島β細胞葡萄糖毒性的發(fā)生發(fā)展機制進一步理解和認識。此外，本研