人參總皂苷聯(lián)合大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對高糖損傷 INS-1細胞的作用.pdf

1、 目的：通過連續(xù)性高糖刺激大鼠胰島β細胞株INS-1細胞,造成細胞活力及細胞功能的損傷后,撤去高糖環(huán)境。在不同藥物濃度人參總皂苷(TSPG)干預下,通過Transwell共培養(yǎng)小室,與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)間接共培養(yǎng),觀察各組 INS-1 細胞細胞功能相關的關鍵轉錄因子肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物 A 基因(MafA)、胰腺十二指腸同源盒-1(PDX-1)的表達變化,基礎胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌情況,及共培養(yǎng)階

2、段細胞外液中轉化生長因子-β(TGF-β)的含量,以確定INS-1細胞與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞間接共培養(yǎng)或者在人參總皂苷干預下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與INS-1細胞間接共培養(yǎng)能否修復高糖損傷的INS-1細胞及可能機制。方法：體外培養(yǎng)大鼠胰島β細胞株INS-1細胞和大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs),給予INS-1細胞連續(xù)性高糖刺激72小時后,停止高糖刺激,并通過Transwell共培養(yǎng)小室與BM-MSCs進行間接共培養(yǎng)。實驗分為6組：1

3、.正常對照組：未經(jīng)高糖刺激的正常INS-1細胞；2.INS-1 細胞損傷模型對照組：經(jīng)連續(xù)性高糖刺激的 INS-1 細胞；3. 無TSPG共培養(yǎng)組：高糖刺激后的INS-1細胞+BM-MSCs共培養(yǎng)組；4. 50mg/L TSPG共培養(yǎng)組： 50mg/L TSPG +高糖刺激后的INS-1細胞+BM-MSCs；5. 100mg/L TSPG共培養(yǎng)組：100mg/L TSPG+高糖刺激后的INS-1細胞+BM-MSCs ；6. 200mg/

4、L TSPG共培養(yǎng)組：200mg/L TSPG+高糖刺激后的INS-1細胞+BM-MSCs。培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)結束后,分別提取各組INS-1細胞總RNA和蛋白,RT-PCR檢測MafA、PDX-1mRNA的表達水平；WB檢測 PDX-1的蛋白表達變化；ELISA檢測各組INS-1細胞基礎胰島素分泌、葡萄糖刺激的胰島素分泌及共培養(yǎng)階段細胞外液中TGF-β含量。結果：(1)INS-1細胞高糖損傷模型的建立：與5.6mmol/l葡萄糖濃度的對

5、照組相比,20、30、40mmol/l濃度的葡萄糖處理后,各組細胞的OD值均有下降。參考國內(nèi)外相關研究,選取在刺激時間為72h,對INS-1細胞功能亦有明顯損傷作用的30mmol/L的葡萄糖濃度作為建模濃度。(2)TSPG對INS-1細胞的毒性作用：400及800mg/L TSPG干預后,細胞OD值明顯下降,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05),提示這一濃度范圍的TSPG能抑制INS-1細胞的活力與增殖。故本實驗選取50、

6、100及200mg/L的TSPG濃度為干預濃度。(3)各組INS-1細胞MafA、PDX-1 mRNA的表達情況：與正常對照組比較,高糖損傷模型組INS-1細胞MafA及PDX-1 mRNA表達量均有降低,差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。與損傷對照組相比,200mg/L TSPG干預的共培養(yǎng)組 INS-1細胞MafA mRNA表達增強；100mg/L及200mg/L TSPG干預共培養(yǎng)組PDX-1 mRNA表達增加。(4)各組INS-

7、1細胞PDX-1蛋白的表達：與正常對照組相比,高糖損傷模型組的各組 INS-1 細胞PDX-1 蛋白的表達均有下降。與損傷模型對照組比較,共培養(yǎng)組 PDX-1 蛋白表達增加。與無 TSPG 干預的共培養(yǎng)組比較,200mg/L TSPG 干預組PDX-1蛋白表達增加。(5)各組細胞共培養(yǎng)階段細胞外液中TGF-β的含量：與正常對照組相比,高糖損傷對照組細胞外液中 TGF-β含量無明顯變化。與損傷模型對照組比較,共培養(yǎng)組細胞外液中 TGF-β

8、含量明顯增加。(6)各組INS-1細胞基礎胰島素分泌及葡萄糖刺激的胰島素分泌情況：與正常對照組相比,高糖損傷模型組INS-1細胞基礎胰島素和葡萄糖刺激的胰島素分泌量均減少。與損傷對照組比較,共培養(yǎng)各組INS-1細胞基礎胰島素和葡萄糖刺激的胰島素分泌量增加。與無TSPG共培養(yǎng)組比較,不同濃度的TSPG干預共培養(yǎng)組基礎胰島素的分泌量無明顯差異,而100和200 mg/L TSPG干預共培養(yǎng)組葡萄糖刺激的胰島素分泌量增加。結論：(1)BM-M