哈維弧菌表面抗原的克隆和真核表達.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩77頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、哈維弧菌(Vibrio harveyi)是一種能產生單極端鞭毛的革蘭氏陰性桿菌,是海水養(yǎng)殖中常見的致病菌,由其引起的弧菌病是水產養(yǎng)殖經(jīng)濟動物中最為嚴重的疾病之一,造成巨大的經(jīng)濟損失。外膜蛋白(outer membrane proteins,Omps)是革蘭氏陰性菌特有的外膜的主要結構成份,在維持細菌細胞結構穩(wěn)定、細胞的物質交換及細菌的致病過程中起著十分重要的作用,同時,部分病原菌的外膜蛋白有良好的免疫原性,可以刺激機體的發(fā)生免疫應答反應

2、,可能作為疫苗的有效成份。
   根據(jù)已發(fā)表的哈維弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列設計1對特異性引物,應用聚合酶鏈式反應(PCR)方法,自哈維弧菌致病菌株基因組中擴增獲得一段約1000 bp的序列,構建重組載體pMD18-T-OmpU,測序結果表明,該基因與已發(fā)表的哈維弧菌外膜蛋白OmpU基因序列存在98%以上的相似性。該序列在GenBank上的登錄號為FJ919231。構建表達質粒pET30(a)

3、-OmpU后轉化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3),在IPTG誘導下實現(xiàn)高效表達,SDS-PAGE顯示重組蛋白分子質量約為41 kD,與預期基本相符。重組蛋白以包涵體形式表達。以尿素法得到初步純化的重組蛋白,以50μg/mL的劑量注射免疫大黃魚幼魚,經(jīng)間接ELISA法檢測了4~8周后特異性抗體的效價,同時檢測了注射后4周的免疫保護率。結果表明,4~8周內特異性抗體效價持續(xù)升高,達到log28.0以上,4周時的相對免疫保護率為85

4、%。試驗結果顯示了重組哈維弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可能作為亞單位疫苗的開發(fā)對象。
   根據(jù)溶藻弧菌外膜蛋白OmpU的基因序列設計一對引物,應用聚合酶鏈式反應(PCR)方法,從患病鱸魚分離的溶藻弧菌zj2007株基因組中擴增獲得一段約960bp的序列。測序結果證明該序列是溶藻弧菌外膜蛋白OmpU基因。PCR產物經(jīng)定向克隆連接到原核表達載體pET30(a),構建重組表達質粒pET30(a)-VAOmpU,并轉化大腸

5、桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,添加一定量的IPTG誘導表達,SDS-PAGE圖譜檢測到重組蛋白獲得大量表達。Bandscan分析重組蛋白的分子量為48.49kDa,略高于預期分子量(40.49kDa)。為進一步進行溶藻弧菌OmpU的免疫原性研究打下了基礎。
   根據(jù)已發(fā)表哈維弧菌外膜蛋白OmpW的基因序列設計一對特異性引物,應用聚合酶鏈式反應(PCR)方法,從患病鱸魚分離的哈維弧菌zj2008株基因組中擴增獲得

6、一段約600bp的序列。將其克隆到pET30(a)原核表達載體,測序結果證明該序列是哈維弧菌外膜蛋白OmpW基因。將重組質粒pET30(a)-OmpW轉化到大腸桿菌E.coliBL21表達菌株,經(jīng)IPTG誘導后大量表達了目的蛋白;Bandscan分析重組蛋白的分子量為28kDa,與預期分子量(26.69kDa)基本相符。本研究為進一步進行哈維弧菌OmpW的免疫原性研究打下了基礎。
   作為真核細胞,在畢赤酵母中表達中表達蛋白有

7、這很多優(yōu)點,例如,蛋白質加工,折疊和修飾。這些操作就像在大腸桿菌和釀酒酵母中一樣簡單。其比其他真核表達系統(tǒng)如桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)液低廉,快速,簡單,并且通常能有很高的表達水平。這些優(yōu)點使畢赤酵母成為一種非常實用的蛋白表達系統(tǒng)。
   根據(jù)已知的基因序列,設計一對加入EcoRⅠ和NoteⅠ的引物,從本實驗室保存的哈維弧菌zj2008的基因組中擴增出600bp左右的OmpW片段,雙酶切PCR產物和pPIC9K質粒,建立連接體系

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論