CD151促細胞遷移、血管形成及大鼠缺血后肢血運重建.pdf

1、研究背景和目的：雖然近年來外科治療和介入治療均取得了很大進展，但仍然不能徹底解決肢端缺血和心肌缺血性疾病治療中的諸多問題，包括介入治療后血管再狹窄、旁路移植血管再閉塞以及上述疾病發(fā)展致終末小血管彌漫性病變等。通過給予外源性促血管生成因子的重組蛋白或轉染特異性基因，促進缺血組織的血管新生、側支循環(huán)建立、改善缺血以及促進器官功能恢復是近年來研究的新動向。轉導促血管生長信號的細胞膜分子分為兩大類，分別為生長因子受體(growthfactorr

2、eceptors)和整合素(integrins)。目前治療性血管生成涉及的靶點主要集中在生長因子受體這一類，但最近的臨床研究結果并不令人樂觀。對大動脈阻塞性疾病而言，只有在非缺血區(qū)的供血動脈與阻塞處以下的動脈系統(tǒng)之間建立低阻力性連接，即建立側支循環(huán)，才是有效的代償。因此有必要探索更多的促血管生成基因，明確血管生成這一復雜過程中的各個重要成員的作用，合理聯(lián)合應用多種促血管生成基因才能達到滿意的治療效果。 CD151是一種具有四跨膜

3、結構的膜蛋白，能與多種整合素亞型結合形成整合素-CD151復合體，是整合素信號轉導的跨膜連接器，其在細胞黏附、遷移以及體外血管形成中均發(fā)揮著重要的作用。在缺血性疾病中增強CD151的表達，能否促進缺血組織的血管生成，進而達到改善血運重建及恢復缺血組織器官功能的效果目前尚未可知。本研究旨在通過體內外實驗證實，提高CD151基因的表達，能夠促進細胞遷移、體外血管形成以及增強缺血組織血管生成和血運重建。 研究方法：首先通過PCR方法將

4、CD151基因末端連接HA尾(HAtag)，通過更換引物的酶切位點將其分別呈正向和反向克隆到雙鏈腺相關病毒表達載體上(dsAAV)。將其與重組腺相關病毒包裝質粒pXX2和輔助質粒pXX6按摩爾比1：1：1的比例，通過磷酸鈣沉淀法共轉染293細胞，包裝制備rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151，用斑點雜交法測定病毒的滴度。將獲得的病毒轉染Tca8113細胞，經Westernblot檢測CD151蛋白質的表達時間梯度，觀察

5、轉染rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151后CD151蛋白質表達的變化，同時確定最佳的表達時間。 然后將構建的含有正義和反義CD151基因的重組腺相關病毒分別轉染舌鱗癌細胞Tca8113和內皮細胞株ECV304。通過Boyden小室培養(yǎng)和劃痕修復實驗觀察CD151的表達對這兩種細胞的定向遷移和非定向遷移能力的影響。將轉染后的ECV304細胞種植在Matrigel上，觀察其條索狀微血管結構的形成情況。 最

6、后將Wistar大鼠共12只，隨機分為實驗組和對照組，每組各6只。實驗組大鼠右側后肢肌肉注射局部轉染rAAV-CD151，對照組大鼠注射rAAV-GFP(1×1010p.f.u/只)?；蜣D染2周后行股動脈切除術建立右側大鼠后肢缺血模型。通過大鼠損傷評分、后肢皮膚溫度測定、后肢動脈造影和缺血肌肉組織毛細血管密度檢測，觀察缺血肢體血管再生和評價血運重建情況。用RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法檢測兩組大鼠局部缺血肢體CD1

7、51的表達。 實驗結果：成功包裝了攜帶有目的基因的重組腺相關病毒rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151，并獲得了足夠實現(xiàn)生理表達量的病毒滴度(2×1011p.f.u./ml和1×1011p.f.u./ml)。 將rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151分別轉染Tca8113細胞和ECV304細胞，通過Boydan小室培養(yǎng)和劃痕修復試驗證實rAAV-CD151-HA能夠增強這兩種細胞的表達

8、，而轉染rAAV-antiCD151抑制細胞CD151的表達后，這兩種細胞的遷移能力均顯著下降。此外高表達CD151的ECV304細胞在Matrigel形成條索狀結構，并相互連接形成毛細血管網絡。而轉染rAAV-antiCD151阻斷CD151表達后ECV304細胞聚集成團狀。這表明CD151能夠有效地促進細胞遷移和體外血管形成。 rAAV-CD151-HA經肌肉注射轉染大鼠后肢缺血模型后，能有效促進轉染局部肌肉組織CD151的

9、表達，且未見異位表達。轉染rAAV-CD151-HA的實驗組大鼠缺血后肢功能恢復優(yōu)于對照組；局部皮膚溫度較對照組高1.7℃(P＜0.05)，與對側正常肢體皮膚溫度差異無顯著意義；后肢血管造影結果顯示實驗組缺血側血管評分明顯高于對照組，分別為2.56±0.37和1.57±0.39；實驗組缺血后肢肌肉組織毛細血管密度也明顯較對照組高，分別為(609±83.89)/mm2和(507±70.65)/mm2，兩組比較均有顯著性差異(P＜0.05)

10、。 實驗結論：經本研究證實：①rAAV-CD151-HA能增強體外培養(yǎng)細胞CD151的表達，有效促進細胞遷移和體外血管形成； ②rAAV-antiCD151能明顯阻斷體外培養(yǎng)細胞CD151表達，抑制細胞的遷移和體外血管的形成； ③腺相關病毒介導的CD151基因能夠在機體內穩(wěn)定而有效的表達； ④rAAV-CD151能夠顯著提高局部缺血組織的血管再生能力，促進缺血肢體功能的恢復。CD151將成為血管再生治療的