CD151促細(xì)胞遷移、血管形成及大鼠缺血后肢血運(yùn)重建.pdf

1、研究背景和目的：雖然近年來外科治療和介入治療均取得了很大進(jìn)展，但仍然不能徹底解決肢端缺血和心肌缺血性疾病治療中的諸多問題，包括介入治療后血管再狹窄、旁路移植血管再閉塞以及上述疾病發(fā)展致終末小血管彌漫性病變等。通過給予外源性促血管生成因子的重組蛋白或轉(zhuǎn)染特異性基因，促進(jìn)缺血組織的血管新生、側(cè)支循環(huán)建立、改善缺血以及促進(jìn)器官功能恢復(fù)是近年來研究的新動(dòng)向。轉(zhuǎn)導(dǎo)促血管生長信號的細(xì)胞膜分子分為兩大類，分別為生長因子受體(growthfactorr

2、eceptors)和整合素(integrins)。目前治療性血管生成涉及的靶點(diǎn)主要集中在生長因子受體這一類，但最近的臨床研究結(jié)果并不令人樂觀。對大動(dòng)脈阻塞性疾病而言，只有在非缺血區(qū)的供血?jiǎng)用}與阻塞處以下的動(dòng)脈系統(tǒng)之間建立低阻力性連接，即建立側(cè)支循環(huán)，才是有效的代償。因此有必要探索更多的促血管生成基因，明確血管生成這一復(fù)雜過程中的各個(gè)重要成員的作用，合理聯(lián)合應(yīng)用多種促血管生成基因才能達(dá)到滿意的治療效果。 CD151是一種具有四跨膜

3、結(jié)構(gòu)的膜蛋白，能與多種整合素亞型結(jié)合形成整合素-CD151復(fù)合體，是整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜連接器，其在細(xì)胞黏附、遷移以及體外血管形成中均發(fā)揮著重要的作用。在缺血性疾病中增強(qiáng)CD151的表達(dá)，能否促進(jìn)缺血組織的血管生成，進(jìn)而達(dá)到改善血運(yùn)重建及恢復(fù)缺血組織器官功能的效果目前尚未可知。本研究旨在通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，提高CD151基因的表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移、體外血管形成以及增強(qiáng)缺血組織血管生成和血運(yùn)重建。 研究方法：首先通過PCR方法將

4、CD151基因末端連接HA尾(HAtag)，通過更換引物的酶切位點(diǎn)將其分別呈正向和反向克隆到雙鏈腺相關(guān)病毒表達(dá)載體上(dsAAV)。將其與重組腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒pXX2和輔助質(zhì)粒pXX6按摩爾比1：1：1的比例，通過磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝制備rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151，用斑點(diǎn)雜交法測定病毒的滴度。將獲得的病毒轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，經(jīng)Westernblot檢測CD151蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)間梯度，觀察

5、轉(zhuǎn)染rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151后CD151蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，同時(shí)確定最佳的表達(dá)時(shí)間。 然后將構(gòu)建的含有正義和反義CD151基因的重組腺相關(guān)病毒分別轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞Tca8113和內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304。通過Boyden小室培養(yǎng)和劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察CD151的表達(dá)對這兩種細(xì)胞的定向遷移和非定向遷移能力的影響。將轉(zhuǎn)染后的ECV304細(xì)胞種植在Matrigel上，觀察其條索狀微血管結(jié)構(gòu)的形成情況。 最

6、后將Wistar大鼠共12只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各6只。實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)后肢肌肉注射局部轉(zhuǎn)染rAAV-CD151，對照組大鼠注射rAAV-GFP(1×1010p.f.u/只)?；蜣D(zhuǎn)染2周后行股動(dòng)脈切除術(shù)建立右側(cè)大鼠后肢缺血模型。通過大鼠損傷評分、后肢皮膚溫度測定、后肢動(dòng)脈造影和缺血肌肉組織毛細(xì)血管密度檢測，觀察缺血肢體血管再生和評價(jià)血運(yùn)重建情況。用RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法檢測兩組大鼠局部缺血肢體CD1

7、51的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成功包裝了攜帶有目的基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151，并獲得了足夠?qū)崿F(xiàn)生理表達(dá)量的病毒滴度(2×1011p.f.u./ml和1×1011p.f.u./ml)。 將rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151分別轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞和ECV304細(xì)胞，通過Boydan小室培養(yǎng)和劃痕修復(fù)試驗(yàn)證實(shí)rAAV-CD151-HA能夠增強(qiáng)這兩種細(xì)胞的表達(dá)

8、，而轉(zhuǎn)染rAAV-antiCD151抑制細(xì)胞CD151的表達(dá)后，這兩種細(xì)胞的遷移能力均顯著下降。此外高表達(dá)CD151的ECV304細(xì)胞在Matrigel形成條索狀結(jié)構(gòu)，并相互連接形成毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。而轉(zhuǎn)染rAAV-antiCD151阻斷CD151表達(dá)后ECV304細(xì)胞聚集成團(tuán)狀。這表明CD151能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞遷移和體外血管形成。 rAAV-CD151-HA經(jīng)肌肉注射轉(zhuǎn)染大鼠后肢缺血模型后，能有效促進(jìn)轉(zhuǎn)染局部肌肉組織CD151的

9、表達(dá)，且未見異位表達(dá)。轉(zhuǎn)染rAAV-CD151-HA的實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血后肢功能恢復(fù)優(yōu)于對照組；局部皮膚溫度較對照組高1.7℃(P＜0.05)，與對側(cè)正常肢體皮膚溫度差異無顯著意義；后肢血管造影結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)血管評分明顯高于對照組，分別為2.56±0.37和1.57±0.39；實(shí)驗(yàn)組缺血后肢肌肉組織毛細(xì)血管密度也明顯較對照組高，分別為(609±83.89)/mm2和(507±70.65)/mm2，兩組比較均有顯著性差異(P＜0.05)

10、。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：經(jīng)本研究證實(shí)：①rAAV-CD151-HA能增強(qiáng)體外培養(yǎng)細(xì)胞CD151的表達(dá)，有效促進(jìn)細(xì)胞遷移和體外血管形成； ②rAAV-antiCD151能明顯阻斷體外培養(yǎng)細(xì)胞CD151表達(dá)，抑制細(xì)胞的遷移和體外血管的形成； ③腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CD151基因能夠在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定而有效的表達(dá)； ④rAAV-CD151能夠顯著提高局部缺血組織的血管再生能力，促進(jìn)缺血肢體功能的恢復(fù)。CD151將成為血管再生治療的