CD151-AAA194-196的表達(dá)對大鼠缺血后肢血管新生影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:血管新生是體內(nèi)重要的病理生理過程，在腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤以及缺血性疾病的血運(yùn)重建等病理生理過程中發(fā)揮著十分重要的作用，它是指內(nèi)皮細(xì)胞通過增殖和分化在原有血管基礎(chǔ)上以芽生或非芽生的形式生成血管。目前關(guān)于血管形成的基本機(jī)制還存在爭議，但是整合素在血管形成的過程中發(fā)揮重要的作用這一觀點(diǎn)已得到認(rèn)同。整合素是位于細(xì)胞表面的異二聚體粘著受體，與胞外基質(zhì)蛋白相結(jié)合，由一個α亞基和一個β亞基組成，a3b1和a6b1是層粘連蛋白連接整合素，可以和四跨

2、膜超家族蛋白（tetraspanins）形成復(fù)合體。CD151是四跨膜超家族蛋白（TM4SF）的最重要成員之一，他可以通過通過胞外大環(huán)特異性位點(diǎn)QRD194-196與整合素a3b1或a6b1相連，形成CD151–a3b1/a6b1功能性復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、粘附功能以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，過去的研究表明CD151能促進(jìn)缺血心肌和缺血后肢組織的血管新生，改善這些組織器官的功能。有研究表明CD151抗體也可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程

3、，相似的結(jié)果也可以在應(yīng)用整合素α3抗體的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到，基于這些發(fā)現(xiàn)，推測切斷CD151與整合素a3b1，a6b1之間的連接可以抑制血管新生。在本研究中，構(gòu)建了整合素a3/a6結(jié)合缺陷的CD151–QRD194–196→AAA，通過重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)將CD151–QRD194–196→AAA突變體轉(zhuǎn)染至大鼠后肢肌肉組織中，然后建立后肢缺血模型，觀察CD151突變體的基因表達(dá)能否促進(jìn)缺血后肢的血管新生過程，同時觀察該突變體對

4、FAK，PI3K/Akt/eNOS通路、ERK通路、Cdc42和Rac1通路的影響，通過上述研究結(jié)果進(jìn)一步揭示CD151促血管新生的分子機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1．構(gòu)建pAAV-GFP、pAAV-CD151以及pAAV-CD151–QRD194–196→AAA質(zhì)粒。擴(kuò)增、提取、純化質(zhì)粒后，使用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法包裝制備rAAV-GFP，rAAV-CD151和rAAV-CD151–AAA突變體病毒。病毒包裝成功后通過斑

5、點(diǎn)雜交法來檢測所包裝的病毒的滴度。
　　 2．成年雄性Wistar大鼠30只（重200～250g）隨機(jī)分為5組，每組6只，其中四組分別給于生理鹽水，rAAV-GFP，rAAV-CD151和rAAV-CD151–AAA194–196(1.5×l011 pfu/只)分點(diǎn)注射至大鼠左側(cè)后肢肌肉組織內(nèi)，注射位點(diǎn)分別為：股四頭肌(3點(diǎn))、股內(nèi)收肌(3點(diǎn))、半膜肌(2點(diǎn))，腓腸肌(2點(diǎn))，每個注射位點(diǎn)100ul基因，轉(zhuǎn)染1周后行股動脈切除術(shù)

6、建立大鼠后肢缺血模型，假手術(shù)組施行相同的手術(shù)步驟但不切除股動脈。基因轉(zhuǎn)染5周后測定后肢皮膚溫度；免疫組化法檢測缺血肌肉組織毛細(xì)血管密度；Western blot免疫印跡和免疫組化法檢測各組大鼠缺血肢體局部CD151的表達(dá)；同時Western blot免疫印跡檢測FAK、PI3K、Akt、eNOS、ERK、Rac1/Cdc42的表達(dá)情況，了解CD151-AAA突變體對FAK-MAPKs，F(xiàn)AK-PI3K和Rac1/Cdc42信號通路的影響

7、。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1．經(jīng)過基因測序鑒定，成功構(gòu)建了pAAV-CD151-AAA194-196突變體。斑點(diǎn)雜交法檢測各包裝病毒的滴度可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。
　　 2．術(shù)后5周，CD151和CD151–AAA194–196組的CD151蛋白及AAA194–196突變體蛋白表達(dá)水平明顯高于其余各組，CD151和CD151–AAA194–196組兩組蛋白水平無明顯差別，但CD151組大鼠缺血后肢平均皮膚溫度和毛細(xì)血

8、管密度明顯高于CD151–AAA194–196組，同時CD151–AAA194–196組大鼠缺血后肢平均皮膚溫度和毛細(xì)血管密度與生理鹽水組和GFP組相比無明顯差別，此外，Western blot的結(jié)果顯示，CD151組磷磷酸化ERK，酸化FAK，PI3K，磷酸化Akt，磷酸化eNOS和磷酸化Rac1/cdc42的蛋白表達(dá)明顯增加，顯著高于其余各組。而CD151-AAA組上述細(xì)胞信號分子的表達(dá)沒有明顯增加。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:

9、>　　 1．成功構(gòu)建了pAAV-CD151-AAA194-196突變體并且包裝成重組腺相關(guān)病毒。
　　 2．研究證實(shí)CD151促血管新生是通過形成CD151-整合素a3/a6復(fù)合體而實(shí)現(xiàn)的，CD151-整合素a3/a6復(fù)合體的形成是CD151促血管新生的始動機(jī)制，CD151-整合素a3/a6復(fù)合體通過激活FAK-MAPKs，F(xiàn)AK-PI3K和Rac1/Cdc42等信號通路來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)血管新生的作用。
　　 3．CD151