阻斷TGF-β信號(hào)通路增強(qiáng)NK-92細(xì)胞過繼性治療的抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、目的：通過oligo化學(xué)合成及PCR擴(kuò)增法合成人顯性抑制TGF-βⅡ型受體（Dominant-negative transforming growth factor-β receptor Ⅱ，DNTβR Ⅱ）目的基因，構(gòu)建pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ真核表達(dá)質(zhì)粒；利用Nucleofector技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞，觀察阻斷TGF-β信號(hào)通路的NK-92細(xì)胞的體外抗腫瘤效應(yīng)；建立裸鼠荷Calu-6人肺癌細(xì)胞皮下移植瘤模型

2、，觀察阻斷TGF-β信號(hào)通路的NK-92細(xì)胞過繼性治療的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。
　　 方法：（1）根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)確定DNTβR Ⅱ目的基因，利用化學(xué)合成法進(jìn)行單鏈oligo的合成，PCR法將合成的oligo拼接成完整的序列，裝入PMD18-T載體并轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)XhoI和EcoRI酶切后連接至目的載體pIRES2-AcGFP中，酶切電泳和DNA測(cè)序鑒定，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)。（2）流

3、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK-92細(xì)胞TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體表達(dá)情況，ELISA法檢測(cè)Calu-6、A-549、MDA-MB231和HT-29四種腫瘤細(xì)胞系的TGF-β1分泌水平；采用Nucleofector技術(shù)將pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ質(zhì)粒和plRES2-AcGFP對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR法及倒置熒光顯微鏡檢測(cè)DNTβR Ⅱ在NK-92細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及表達(dá)，western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NK-92細(xì)胞

4、Smad2蛋白的活化狀態(tài)；將分泌水平最高的Calu-6細(xì)胞系與TGF-β1（終濃度10ng/ml）共孵育24小時(shí)，CCK-8法比較轉(zhuǎn)染后的NK-92細(xì)胞對(duì)Calu-6人肺癌細(xì)胞系的體外殺傷活性。（3）采用細(xì)胞懸液接種法，將Calu-6細(xì)胞（1×106）接種于裸鼠背部皮下；成瘤實(shí)驗(yàn)同期經(jīng)尾靜脈分別輸注轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP的NK-92細(xì)胞（B組）和轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ的NK-92細(xì)胞（C組），A組不予另外處理

5、，接種后第10天比較各組成瘤率；抑瘤實(shí)驗(yàn)于接種后第10天、17天經(jīng)尾靜脈進(jìn)行2次過繼性輸注，分為生理鹽水組（a組）、NK92/pIRES2-AcGFP組（b組）和NK92/pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ組（c組），接種第564處死動(dòng)物；比較各組皮下移植瘤體積、生存期變化及外周血IFN-γ水平，肺轉(zhuǎn)移情況。
　　 結(jié)果：（1）合成DNA經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與目的基因一致，真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ轉(zhuǎn)染后，倒

6、置熒光顯微鏡證實(shí)DNTβRⅡ在COS-7細(xì)胞的表達(dá)。（2）Calu-6細(xì)胞系在四種腫瘤細(xì)胞系TGF-β1表達(dá)水平最高；流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了NK-92細(xì)胞表面TβRI、TβR Ⅱ的高表達(dá)；采用Nucleofector技術(shù)，plRES2-AcGFP和pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ質(zhì)粒對(duì)NK-92細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為28.53％和18.86％，RT-PCR和倒置熒光顯微鏡證實(shí)了DNTβR Ⅱ的表達(dá)，western blot顯示雖有TGF

7、-β的刺激，轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ質(zhì)粒的NK-92細(xì)胞未見Smad2蛋白的活化。Calu-6細(xì)胞與TGF-β1共孵后，NK-92細(xì)胞對(duì)Calu-6細(xì)胞的殺傷活性較共孵前明顯減弱（P<0.001）；轉(zhuǎn)染DNTβRⅡ陽性質(zhì)粒的NK-92細(xì)胞對(duì)Calu-6細(xì)胞殺傷活性明顯高于GFP轉(zhuǎn)染組（P<0.001）。（3）成瘤實(shí)驗(yàn)顯示3組間成瘤率存在差異，C組成瘤率低于A組（P<0.05）。抑瘤實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染DNTβR Ⅱ陽性質(zhì)粒的

8、NK-92細(xì)胞（c組）過繼性治療后裸鼠皮下移植瘤體積縮小，肺轉(zhuǎn)移率下降，生存期明顯延長(zhǎng)，外周血IFN-γ水平明顯增高。
　　 結(jié)論：（1）成功構(gòu)建pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ真核表達(dá)質(zhì)粒，為阻斷NK-92細(xì)胞的TGF-β信號(hào)通路提供了載體；（2）Nucelofector核轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)了pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ質(zhì)粒在NK-92細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)染和表達(dá)；（3）pIRES2-AcGFP-DNTβR Ⅱ質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染在