攜帶NKG2D配體和Herceptin的腺病毒聯(lián)合NK-92細(xì)胞殺傷腫瘤作用的研究.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells, NK cells）是天然免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，在機(jī)體抵抗病毒感染和抗腫瘤的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，不需要預(yù)先的致敏便能殺傷發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和感染的細(xì)胞，而不損傷正常細(xì)胞。主要分布于脾臟、骨髓、淋巴結(jié)和外周血等處，可在各種趨化因子的誘導(dǎo)下，向炎癥等部位遷移。NK細(xì)胞表面存在多種抑制型和激活型的受體，各種信號通過這些受體的傳遞，實(shí)現(xiàn)NK細(xì)胞的抑制或激活。NK-92細(xì)胞是從一個(gè)非霍奇金淋

2、巴瘤患者體內(nèi)分離建立的一種NK細(xì)胞系，容易在體外進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)增，克服了NK細(xì)胞分離和培養(yǎng)的諸多不便，被廣泛地應(yīng)用于免疫治療研究。
　　 NKG2D是一個(gè)多亞基的細(xì)胞表面受體復(fù)合物，屬于C型凝集素樣受體家族中的一員，表達(dá)于αβ CD8T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的表面，是NK細(xì)胞的一種重要的激活型受體，能與多種不同的配體分子相作用而激活NK細(xì)胞。主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)分子A(Major Histocompati

3、bility Complex class I related Chain A， MICA)是NKG2D的主要配體，由383個(gè)氨基酸組成，具有3個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域（a1、a2和a3）、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞質(zhì)尾區(qū)。在正常情況下，只在成纖維細(xì)胞、胃腸上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等處表達(dá)，但在多種腫瘤細(xì)胞表面均存在表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，NK細(xì)胞對這類細(xì)胞具有更高的殺傷活性。
　　 Herceptin是獲美國FDA許可的用于治療Her-2過表達(dá)乳腺癌患者的一

4、種重組的人源化單克隆抗體，能特異地與靶細(xì)胞表面的Her-2受體相結(jié)合，抑制Her-2過表達(dá)腫瘤的生長，通過與化療治療的聯(lián)合用藥，雖取得了一定的療效，但治愈率低，仍待進(jìn)一步的改進(jìn)。
　　 為獲得更好的抗腫瘤效果，本研究欲整合Herceptin靶向地結(jié)合作用于Her-2陽性腫瘤細(xì)胞和MICA特異地活化NK細(xì)胞的功能，構(gòu)建具有雙重功能的Herceptin與MICA的融合蛋白，通過融合蛋白的抗體部分與Her-2陽性的腫瘤細(xì)胞相結(jié)合，再通

5、過MICA部分與NK細(xì)胞結(jié)合，在增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性的同時(shí)，還能使NK細(xì)胞更多地聚集在靶細(xì)胞的周圍，對靶細(xì)胞進(jìn)行更有效地殺傷。
　　 本文先是通過Overlap-PCR的方法構(gòu)建了Herceptin全長抗體基因與MICA的胞外結(jié)構(gòu)域部分基因的融合基因--Herceptin-MICA(E)，再將該融合基因重組進(jìn)-5型腺病毒，并用該重組腺病毒感染293細(xì)胞而獲得所需的融合蛋白，通過ELISA和Western blot的方法檢測融合蛋

6、白在上清中的表達(dá)情況，并用間接免疫熒光分析( Indirect immunofluorescenceAssay, IFA)檢測蛋白與細(xì)胞表面Her-2受體的結(jié)合特性，最后用乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)，研究該融合蛋白對于NK細(xì)胞殺傷SK-OV-3細(xì)胞（一種Her-2陽性的卵巢癌細(xì)胞株）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒Ad5-Herceptin-MICA(E)在體外能夠順利表達(dá)預(yù)期大小分子量的融合蛋白Herceptin-MICA(E)，同時(shí)，在感染48

7、h后的細(xì)胞上清中，其表達(dá)量為(471.93±12.33)ng/ml;經(jīng)Herceptin-MICA(E)處理的SK-OV-3細(xì)胞能在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，其熒光強(qiáng)度與商品化的Herceptin的相似；細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)（乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)，在不同效靶比的實(shí)驗(yàn)處理組中（1:1、3:1、10:1和30:1），與未做處理的對照組及經(jīng)Herceptin處理實(shí)驗(yàn)組的SK-OV-3細(xì)胞相比，NK-92細(xì)胞對預(yù)先用Herceptin-MICA