丙型肝炎患者PBMC蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析及生物標記分子的尋找.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所引起的丙型肝炎呈全球性分布。據(jù)WHO估計，目前全世界約有1.8億HCV感染者，且呈增長趨勢。HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高達75％-85％，可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，對人類的健康和生命構(gòu)成嚴重威脅。 目前對于HCV持續(xù)感染及導致慢性肝疾病的機理仍不十分清楚。蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)和方法的出現(xiàn)為我們從蛋白質(zhì)整體水平探討HCV的

2、致病機理及丙型肝炎慢性化機制提供了很好的思路。蛋白質(zhì)組是指由一個基因組(genome)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)(protein)。它是對應(yīng)于一個基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，而不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(proteomics)以蛋白質(zhì)為研究對象，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。 HCV無逆轉(zhuǎn)錄酶活性，只在細

3、胞胞漿內(nèi)復制，不能與宿主基因整合，主要通過其表達的蛋白質(zhì)起作用。核心蛋白(core)是HCV多聚蛋白前體經(jīng)細胞信號肽酶剪切而產(chǎn)生的非糖基化蛋白，由191個氨基酸組成。該蛋白的氨基酸序列十分保守，具有調(diào)控多種細胞基因，影響細胞生長、增生及凋亡的能力。近年來外國學者在感染HCV的患者血清中發(fā)現(xiàn)了HCV-F蛋白，是由HCV核心基因編碼的另一個產(chǎn)物，它是由核心基因密碼子核苷酸移位后產(chǎn)生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者體內(nèi)抗體的存在，

4、提示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。 第一部分HCV患者外周血單個核細胞蛋白質(zhì)表達質(zhì)譜分析分別分離丙型肝炎患者和健康供血者的外周血單個核細胞(PBMCs)，制備蛋白樣品并用BradFord法定量。應(yīng)用固相化pH梯度雙向凝膠電泳(2-DE)分離健康者(10)及HCV患者(28)PBMCs的總蛋白質(zhì)，凝膠銀染顯色后，用PDQuest圖像分析軟件進行比較分析、識別差異表達的蛋白質(zhì)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-

5、TOF-MS)獲得差異蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，通過SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。得到兩張2-DE圖譜，HCV患者及健康者PBMCs凝膠的蛋白質(zhì)點數(shù)分別為625及614；初步篩選出HCV患者與健康者存在明顯差異的12個蛋白點，經(jīng)質(zhì)譜分析，初步鑒定了10種蛋白質(zhì)。這些差異蛋白質(zhì)包括病毒蛋白、蛋白質(zhì)合成與分解、三大代謝相關(guān)酶類、細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)以及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白質(zhì)，為研究丙型肝炎慢性化機制提供了新的線索。 　　第

6、二部分HCV-F基因在hepG2細胞中的表達以及對PI3K的影響根據(jù)Genbank提供的HCV 1b型序列設(shè)計引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從含有HCV全長開放閱讀框的質(zhì)粒中獲得HCV-F基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，電泳回收后與用上述限制性內(nèi)切酶雙酶切后電泳回收的pcDNA3.0(-)質(zhì)粒連接，獲得的重組質(zhì)粒(pcDNA3.0-F)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞。通過酶切、PCR及測序鑒定，HCV-F基因已正