蛋白質(zhì)組學(xué)多維色譜質(zhì)譜分析平臺(tái)新技術(shù)新方法研究.pdf

1、人類基因組測(cè)序計(jì)劃完成后，蛋白質(zhì)組學(xué)研究被提上了日程。蛋白質(zhì)組學(xué)包括表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)兩部分內(nèi)容。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究基因編碼所有蛋白質(zhì)的識(shí)別和定量，及其在細(xì)胞中的定位和在后轉(zhuǎn)錄階段進(jìn)行的修飾。而功能蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，確定蛋白質(zhì)在特定通道和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的作用，說(shuō)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系。 識(shí)別蛋白質(zhì)其實(shí)是對(duì)生物體內(nèi)所有表達(dá)蛋白質(zhì)種類的測(cè)定，鑒于復(fù)雜生物體表達(dá)蛋白質(zhì)有幾十萬(wàn)種，有效的分離蛋白質(zhì)混

2、合物對(duì)于后序正確的鑒定極為重要。兩維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DGel)是利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差別進(jìn)行正交分離的分析方法。從1975年建立至今因其無(wú)法比擬的高分辨率在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中始終占據(jù)重要地位。然而2-DGel也有一些難以克服的缺陷，比如有限的動(dòng)態(tài)范圍和分離樣品中分子量差別較大的蛋白質(zhì)，低含量的蛋白質(zhì)(如信號(hào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子)以及疏水性蛋白質(zhì)(膜蛋白和跨膜蛋白)能力較差，另外其操作過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，自動(dòng)化程度低，并且難于實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜

3、的直接聯(lián)用。在大規(guī)模高通量研究蛋白質(zhì)組學(xué)的今天，2一DGel這些缺陷日益明顯地限制了它更為廣泛的應(yīng)用?？焖?，高效，自動(dòng)化程度高的新型分離技術(shù)亟待發(fā)展與應(yīng)用。 近年來(lái)，高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳(CE)的發(fā)展為蛋白質(zhì)和多肽的分離分析提供了新手段。然而一維分離模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限，為了對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行更有效地分離分析，研究者嘗試聯(lián)用色譜電泳等分離手段以提高分辨率。與一維分離模式相比，多維分離技術(shù)的最

4、大特點(diǎn)是擁有更大的峰容量。根據(jù)Giddings建立的數(shù)學(xué)模型，多維分離系統(tǒng)的峰容量應(yīng)為其包含各單維分離模式峰容量的乘積。即如果聯(lián)用的n維峰容量分別為N1，N2……№，則總峰容量為M×N2…№。極大的峰容量對(duì)于有效分離復(fù)雜樣品是十分有利的。 多維色譜分離平臺(tái)建立過(guò)程中最重要的兩方面一是選用何種分離模式聯(lián)用，二是如何實(shí)現(xiàn)聯(lián)用。各種分離模式只有分離機(jī)理正交才能最大限度的提高峰容量，同時(shí)也要兼顧到不同分離模式所適用樣品，使用流動(dòng)相間的匹

5、配問(wèn)題。如何實(shí)現(xiàn)聯(lián)接不僅包括分離模式內(nèi)部的聯(lián)接，最后一維與檢測(cè)器的聯(lián)接也要考慮在內(nèi)。一維色譜及電泳分離模式多樣，多維聯(lián)用可在色譜內(nèi)部，電泳內(nèi)部及色譜電泳之間進(jìn)行。研究者要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況及樣品來(lái)選擇合適的聯(lián)用模式，并實(shí)現(xiàn)聯(lián)接以應(yīng)用于實(shí)際分析。 無(wú)論是2-DGel還是多維色譜分離技術(shù)，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)分離后都要進(jìn)入生物質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。生物質(zhì)譜常采用的兩種電離技術(shù)是電噴霧電離(ESI)和基體輔助激光誘導(dǎo)解吸電離(MALDI)。分離后

6、的肽段或蛋白質(zhì)離子化后進(jìn)入質(zhì)譜，進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量分析，所得數(shù)據(jù)送入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)身份。建立多維色譜分離平臺(tái)，并將之與生物質(zhì)譜聯(lián)用以分析生物體組織或細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜是本論文所涉及的最重要的工作。 論文第一章對(duì)多維分離技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行了綜述，主要包括由不同單維分離模式組成的兩維及三維分離系統(tǒng)及其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用。 第二章建立并優(yōu)化了在線兩維液質(zhì)聯(lián)用分離分析系統(tǒng)，并應(yīng)用于肝臟樣品和肝臟細(xì)胞核表達(dá)蛋白質(zhì)組的

7、分析。利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合樣品對(duì)SCX-RPLC兩維系統(tǒng)的檢測(cè)限和分離能力進(jìn)行了考察，分別優(yōu)化了強(qiáng)陽(yáng)離子交換臺(tái)階式鹽進(jìn)樣洗脫條件和反相分離所采用的連續(xù)梯度洗脫條件，比較了商品預(yù)柱與實(shí)驗(yàn)室自制預(yù)柱對(duì)樣品的捕捉及富集能力，并將自制預(yù)柱替代商品預(yù)柱用于實(shí)際樣品分析。利用nano-flow2-DLC-MS／MS系統(tǒng)對(duì)順序提取的鼠肝蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行了鑒定，水溶性蛋白質(zhì)鑒定出450個(gè)，尿素提取部分鑒定出339個(gè)，共鑒定出687個(gè)蛋白質(zhì)；同時(shí)利用該系統(tǒng)分

8、析了C57小鼠肝臟核蛋白質(zhì)表達(dá)譜，五次并行分析共鑒定得到462個(gè)蛋白質(zhì)。 第三章發(fā)展了ESI-MS／MS和MAIDI-MS／MS并行鑒定技術(shù)，并與兩維液相分離聯(lián)用以分析復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品。MALDI與ESI離子化機(jī)理顯著不同，兩者對(duì)同一樣品進(jìn)行分析時(shí)，獲得的信息既可相互確認(rèn)又能形成補(bǔ)充。目前為止沒(méi)有質(zhì)譜可同時(shí)進(jìn)行ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS測(cè)定，我們發(fā)展的并行鑒定技術(shù)旨在實(shí)現(xiàn)ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS同

9、時(shí)檢測(cè)，從而挖掘出更全面的樣品信息。實(shí)驗(yàn)中利用柱后分流將ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS連接到同一色譜分離過(guò)程之后，一部分進(jìn)行ESI-MS／MS分析，另一部分點(diǎn)樣在MALDI靶板上利用MALl)I-MS／MS分析。利用該并行鑒定系統(tǒng)對(duì)人肝組織蛋白質(zhì)提取樣品進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示并行鑒定技術(shù)無(wú)論在蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量還是可信程度上都優(yōu)于單獨(dú)串級(jí)質(zhì)譜分析。 第四章發(fā)展了反相液相色譜毛細(xì)管電泳串級(jí)質(zhì)譜平臺(tái)。首次實(shí)現(xiàn)了RPLC-C

10、ZE兩維系統(tǒng)與串級(jí)質(zhì)譜的聯(lián)接并將之應(yīng)用到實(shí)際生物樣品分離鑒定工作中。利用自行發(fā)展的重力進(jìn)樣接口和CZE-MALDI接口聯(lián)接RPLC，CZE和MALDI-MS。傳統(tǒng)LC-CE接口使用時(shí)，電泳兩端只能施加負(fù)高壓，我們所設(shè)計(jì)的新型RPLC-CZE進(jìn)樣接口可在正高壓下使用，它與CZE-MALDI接口一起保證在進(jìn)行快速電泳分離的同時(shí)電泳流分可持續(xù)穩(wěn)定地點(diǎn)在MALDI靶板上。快速兩維系統(tǒng)工作條件包括接口操作條件，電泳分離條件，點(diǎn)樣頻率等進(jìn)行了優(yōu)化。

11、整個(gè)兩維體系的分離時(shí)間只相當(dāng)于一維反相分離所需時(shí)間，而峰容量比一維反相提高了約一個(gè)數(shù)量級(jí)。利用該快速全二維分離鑒定系統(tǒng)，我們分析了肝癌高轉(zhuǎn)移潛能小鼠肝臟表達(dá)蛋白質(zhì)，90分鐘分離獲得1350張串級(jí)質(zhì)譜圖，鑒定了2000條信噪比大于20的肽段和384個(gè)蛋白質(zhì)，鑒定結(jié)果顯示了RPLC—CZE—MALDI—MS/MS分離分析平臺(tái)在快速高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。 第五章構(gòu)建了SEC-SCX-RPLC-ESI-MS／MS三維分離分析

12、平臺(tái)。此體系在SCX-RPLC-MS／MS兩維鑒定平臺(tái)上發(fā)展而成，通過(guò)引,NSEC分離模式提高整個(gè)多維分離系統(tǒng)的峰容量和上樣量，從而解決兩維系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品分離不充分而導(dǎo)致蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量和可信度難以提高的問(wèn)題。新一維分離模式的引入，考慮其對(duì)樣品是否有歧視效應(yīng)，分離機(jī)理與后兩維是否正交，模式是否兼容等因素。體積排阻色譜(SEC)依據(jù)分子量分離，對(duì)樣品無(wú)歧視效應(yīng)，其流動(dòng)相可依據(jù)樣品性質(zhì)在酸性、中性、堿性溶液或有機(jī)溶劑中選擇，甚至可加入

13、變性劑或表面活性劑增溶以提高方法重現(xiàn)性。具體實(shí)驗(yàn)中可采用兩種技術(shù)路線。第一條路線中先由SEC分離蛋白質(zhì)，按色譜峰收集流出組分，凍干，酶解，各組分經(jīng)過(guò)SCX-RPLC兩維色譜分離后在線進(jìn)行ESI-MS／MS分析；第二條路線是先酶解蛋白質(zhì)成為肽段，再以SEC-SCX-RPLC三維系統(tǒng)分離，流出肽段進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定分析。新一維SEC分離模式的引入在提高系統(tǒng)峰容量的同時(shí)，也增加了系統(tǒng)上樣量，有利于對(duì)為數(shù)眾多的低豐度蛋白質(zhì)鑒定。論文中分析比較了上