從線粒體細(xì)胞色素b基因和D-LOOP控制區(qū)序列差異研究野牦牛和家牦牛的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系.pdf

1、本文根據(jù)牛屬動(dòng)物線粒體兩端的特征序列，設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR技術(shù)從野牦?；蚪M中擴(kuò)增出線粒體細(xì)胞色素b基因和D-LOOP控制區(qū)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.0％的瓊脂糖凝膠EB電泳、純化、回收后轉(zhuǎn)化，再應(yīng)用抗生素篩選法隨機(jī)挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。鑒定陽性克隆后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用DNASTAR軟件包(DNASTARInc，1996)中的MegAlign程序?qū)ν葱蛄羞M(jìn)行排列，并經(jīng)人工仔細(xì)核查。在此基礎(chǔ)上，序列輸入MEGA2.

2、1軟件包中計(jì)算不同序列間的變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)、顛換百分比、轉(zhuǎn)換/顛換比率、序列間的遺傳距離和差異百分比，用MEGA2.1軟件基于Kimura2-parameter距離采用鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，同時(shí)也用PHYLIP3.6軟件包(Felsenstein，2001)使用Heuristic功能搜尋最大簡約法(MaximumParsimony)和最大擬然法(MaximumLikehood)的系統(tǒng)重建。　

3、　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示線粒體細(xì)胞色素b基因和D-LOOP控制區(qū)PCR擴(kuò)增片段在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中顯示出清晰的特異性擴(kuò)增條帶，經(jīng)連接及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，在LB固體培養(yǎng)基上長出較多陽性克隆。隨機(jī)挑菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，其結(jié)果皆為陽性克隆。說明成功克隆出野牦牛的線粒體細(xì)胞色素b基因和D-LOOP控制區(qū)序列，并將其重組入原核表達(dá)載體。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果經(jīng)DNASTAR、MEGA2.1、PHYLIP3.6軟件包的不同方法(Neighbor-Joining、M