骨髓增生異常綜合征線粒體DNA D-loop區(qū)突變研究.pdf

1、目的:本研究以42例骨髓增生異常綜合征患者及11例由MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者的骨髓標(biāo)本為研究對(duì)象，提取其線粒體DNA，針對(duì)mtDNA D-loop區(qū)的兩個(gè)高變區(qū)(HV1區(qū)和HV2區(qū))設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過直接測(cè)序法對(duì)所擴(kuò)增的基因序列進(jìn)行檢測(cè)，研究不同類型的MDS患者mtDNA突變的特征與規(guī)律，從而探討mtDNA突變?cè)贛DS發(fā)病及疾病轉(zhuǎn)化中的地位和意義。 方法:選擇齊魯醫(yī)院血液科就診的42例MDS患者，其中男17例，女2

2、5例，年齡25～62歲(中位年齡51歲)；4例MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者，其中男2例，女2例，年齡47～62歲(中位年齡56歲)。收取其骨髓液，以3.8％枸櫞酸鈉抗凝，同時(shí)收取其口腔上皮正常組織。提取基因組DNA，用PCR技術(shù)擴(kuò)增線粒體DNA D-loop區(qū)的兩個(gè)高變區(qū)。低溶點(diǎn)膠法回收PCR產(chǎn)物，用T載體克隆PCR純化產(chǎn)物并將含目的片段的菌液送測(cè)序。將所測(cè)線粒體DNA D-loop區(qū)的HV1區(qū)和HV2區(qū)基因序列與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列(revis

3、ed Cambridge reference sequence，rCRS)進(jìn)行對(duì)比。在骨髓標(biāo)本中與劍橋序列不一致的位點(diǎn)再與同一患者的口腔上皮正常組織的序列比較，若此位點(diǎn)的變化在口腔上皮組織中未出現(xiàn)，則定義為突變；若在骨髓標(biāo)本和口腔上皮中均出現(xiàn)，則定義為多態(tài)，在數(shù)據(jù)庫(MITOMAP、mtDB和GenBank)沒有記錄的認(rèn)為是新的多態(tài)位點(diǎn)。 結(jié)果: 1、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：成功擴(kuò)增出mtDNA D-loop區(qū)兩個(gè)高變區(qū)序列，瓊脂糖

4、凝膠電泳分別在470bp和490bp處出現(xiàn)特異條帶。 2、MDS患者mtDNA多態(tài)性改變：在42例MDS患者骨髓標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變199個(gè)，其中在HV1區(qū)(360bp)131個(gè)，單個(gè)標(biāo)本中最少發(fā)現(xiàn)1個(gè)，最多發(fā)現(xiàn)7個(gè)，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.87％；HV2區(qū)(316bp)共68個(gè)，單個(gè)標(biāo)本最少0個(gè)，最多5個(gè)，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.51％。未發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點(diǎn)。 3、MDS患者mtDNA的突變：在42例MDS患者骨髓標(biāo)本中有6例

5、檢測(cè)到突變，突變位點(diǎn)共19個(gè)，計(jì)算突變率為14.29％。突變類型為堿基置換突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失。其中5個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(HV1區(qū)4個(gè)，HV2區(qū)1個(gè))，這中間有4個(gè)是poly-C片段中C核苷數(shù)目的增加。其余14個(gè)突變位點(diǎn)均為A、G或者C、T之間的堿基置換(HV1區(qū)6個(gè)，HV2區(qū)8個(gè))。 4、由MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者的mtDNA多態(tài)性改變：在4例MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變21個(gè)，其中在HV1區(qū)13個(gè)

6、，單個(gè)標(biāo)本最少發(fā)現(xiàn)2個(gè)，最多4個(gè)，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.90％；HV2區(qū)8個(gè)，單個(gè)標(biāo)本最少1個(gè)，最多3個(gè)，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.63％。未發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點(diǎn)。MDS組和急性白血病組多態(tài)性發(fā)生頻率無差異(P>0.05)。 5、由MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者的mtDNA突變：在4例急性白血病患者骨髓標(biāo)本中有3例檢測(cè)到突變，突變位點(diǎn)共4個(gè)，計(jì)算突變率為：75％，突變類型為堿基置換突變和堿基缺失。兩組突變發(fā)生頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

7、。 結(jié)論:在MDS患者中骨髓造血細(xì)胞凋亡過度是引起無效造血的主要原因，而誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)多數(shù)引起線粒體功能的改變，使線粒體內(nèi)膜通透性增加，膜電位破壞，促使細(xì)胞色素C的釋放，從而觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)MDS患者中mtDNA D-loop區(qū)有較高的突變率，由于mtDNA重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子以及重鏈的復(fù)制起始位點(diǎn)均位于D-loop區(qū)，因此D-loop區(qū)的突變將會(huì)影響到mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，直接影響線粒體編碼