新型生物復合材料-HA-ZrO2梯度復合材料對骨髓間充質(zhì)干細胞生長及成骨分化的影響.pdf

1、因創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因造成的骨缺損、骨不愈合一直是骨科治療領域的難題。常用的自體和異體骨移植各有自身難以克服的缺點，不能常規(guī)用于臨床。隨著組織工程的迅猛發(fā)展,為骨缺損修復提供了新的思路和治療途徑。
　　構建理想的的組織工程化骨其前提就是要有生物學特性良好的種子細胞和適合的支架材料,支架材料的選擇是組織工程所需考慮的關鍵問題之一。理想的骨組織工程的支架材料應該滿足以下幾個條件:
　　(1)良好的生物相容性。
　　(

2、2)生物可降解吸收性以及吸收速率的可調(diào)性。
　　(3)一定的機械強度和韌性,在特定的部位能提供與局部環(huán)境相適應的結構上的支持作用。
　　(4)易于加工、塑行以便臨床用。
　　(5)具有三維內(nèi)聯(lián)多孔結構，種子細胞的黏附生長以及周圍組織的長入決定了材料必須具備完備適宜的多孔性,包括一定的空隙率、孔徑大小以及完善的內(nèi)連接系統(tǒng)。
　　(6)材料表面有利于細胞黏附生長、分化。目前在骨組織程中常用的支架材料主要有生物陶瓷、羥

3、基磷灰石(HAP)、人工可降解聚合物等，而多種成分的復合型支架材料的逐漸成為研究熱點。
　　本單位與上海大學高分子材料研究所合作采用干鋪-燒結的方法聯(lián)合研制了一種新型生物復合材料―HA/ZrO2梯度復合材料(Graded irconia-hydro xyap at- ite composite bioceramic)。使氧化鋯材料的高強度、高韌性和HA的生物活性有機地結合起來。根據(jù)國際標準化組織ISO10993-1:1992醫(yī)療器

4、械生物學評價標準和要求，本課題組已對HA/ZrO2梯度復合材料進行了一系列體內(nèi)外實驗研究，前期研究發(fā)現(xiàn)HA/ZrO2梯度復合材料具有良好的骨誘導性和骨傳導性，無細胞毒性、無急性體內(nèi)毒性、不致溶血性，生物相容性和免疫相容性良好，成骨效能優(yōu)，能夠與骨界面形成良好的生物連接。
　　骨組織工程中的種子細胞要求其擴增迅速,與支架材料有良好的相互作用,骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs),因其可通過體外貼壁培養(yǎng)分離,擴增迅速,是一類具有分化潛能的細胞

5、,在特定條件下可以分化為多種組織細胞,如成骨細胞、軟骨細胞、肌腱、脂肪細胞、成纖維細胞以及神經(jīng)星狀細胞等,且具有極強的自我復制能力,是一種理想組織工程種子細胞。以骨髓間充質(zhì)干細胞和HA/ZrO2梯度復合材料復合構建的組織工程化骨有望成為未來骨組織工程研究和應用的主流。
　　組織工程學的重要研究內(nèi)容之一是支架材料對種子細胞生物學行為的影響。目前HA/ZrO2梯度復合材料對MSCs生長及分化的影響尚未得到充分闡明。本研究旨在詳細闡述作

6、為支架材料的HA/ZrO2梯度復合材料對于種子細胞MSCs生長及成骨分化等生物學行為的影響，為未來的相關應用提供數(shù)據(jù)參考。
　　實驗分3個部分進行觀察研究：
　　1.骨髓的獲取及MSCs的分離培養(yǎng)。用密度梯度離心法進行MSCs的原代分離培養(yǎng)、消化傳代，繪制 MSCs的生長曲線及倍增時間。同時進行相關實驗內(nèi)容的檢測分析包括MSCs的成骨誘導分化、Vonkossa染色、堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶（ALP）活性測定、總RNA提取及

7、RT-PCR。
　　2.HA/ZrO2復合材料顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖及成骨分化的影響。以不同濃度的材料懸液作用于骨髓間充質(zhì)干細胞，5天后進行MTT檢測。15天后進行堿性磷酸酶活性測定、Voncossa染色、總RNA提取及RT-PCR。
　　3.骨髓間充質(zhì)干細胞在HA/ZrO2梯度復合材料、HA/ZrO2單純復合材料、純HA及ZrO2四種不同材料表面上貼壁增殖及成骨分化的差異。將細胞以相同濃度接種于不同材料薄片表面進行貼

8、壁增殖實驗。分別于1、4、7、11天后解離細胞并計數(shù)，繪制生長曲線并計算倍增時間。 ALP檢測：分別于第10、20天裂解細胞后測堿性磷酸活性及總蛋白含量。均以普通孔板底面為對照。
　　通過以上研究，為新型生物復合材料-HA/ZrO2梯度復合材料的相關應用提供參考數(shù)據(jù)。
　　實驗獲得以下主要結果和結論：
　　1.本研究采用密度梯度離心法所分離得到的MSCs純度高，經(jīng)體外成骨誘導可向成骨細胞方向分化。
　　2.HA和

9、含有HA的復合材料顆粒均對細胞增殖有一定促進作用。而單純ZrO2顆粒對細胞增殖沒有促進作用。對于細胞分化，實驗結果顯示HA和含有HA的復合材料顆粒均對細胞ALP表達有一定促進作用，說明HA和含有HA的復合材料顆粒均可促進MSCs的成骨分化。
　　3. MSCs接種于HA/ZrO2梯度復合材料、HA/ZrO2單層復合材料、純HA及ZrO2四種不同材料基質(zhì)表面，細胞均可貼壁、增殖與成骨分化。但其貼壁、增殖與分化的特征表現(xiàn)為復合材料基質(zhì)