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文檔簡(jiǎn)介
1、肺癌作為惡性腫瘤之一,也是腫瘤相關(guān)死亡的首位死因,嚴(yán)重影響了人類(lèi)健康和生活質(zhì)量,且目前仍缺乏有效預(yù)防和治療手段。而吸煙則是人類(lèi)肺癌發(fā)生發(fā)展的首要危險(xiǎn)因素,已有許多流行病學(xué)研究證實(shí)吸煙者的肺癌患病率顯著高于非吸煙者的肺癌患病率。盡管香煙煙霧能夠增加肺部疾病的患病風(fēng)險(xiǎn),但其誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化引起肺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制復(fù)雜且不易闡明。
最近有大量研究表明許多疾病的發(fā)生發(fā)展不僅與編碼蛋白的RNA有關(guān),同時(shí)也與ncRNA的表達(dá)失調(diào)有關(guān)
2、。ncRNA中包括了最廣為人知的微小RNA(miRNA)以及最近被廣泛研究的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)等。其中l(wèi)ncRNA是一類(lèi)新興且目前研究較熱的大分子ncRNA,其長(zhǎng)度超過(guò)200 nt,同時(shí)也可作為環(huán)境暴露的新的標(biāo)志物,很有可能在驅(qū)動(dòng)暴露疾病關(guān)聯(lián)中發(fā)揮重要作用。有研究表明lncRNA通過(guò)與miRNA相互作用參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展,但關(guān)于lncRNA與miRNA相互作用在環(huán)境有害因素,特別是吸煙所致疾病
3、的發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少。
目的:
探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT1(CCAT1)通過(guò)miR-218和let-7c在香煙煙霧抽提物(CSE)慢性處理所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用,從而揭示CSE所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的部分分子機(jī)制,為尋找吸煙所致肺損傷和肺癌的早期生物標(biāo)志提供科學(xué)線索。
方法:
一、香煙煙霧抽提物對(duì)HBE細(xì)胞lncRNA與miRNA水平的影響
用20μg/mL CS
4、E急性處理HBE細(xì)胞0、6、12或24 h,或慢性處理HBE細(xì)胞0、20、30或40代后,用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR和H19的水平;用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞CCAT1、miR-21、miR-125a、miR-218和let-7c的水平。以觀察CSE對(duì)HBE細(xì)胞lncRNA與miRNA水平的影響。
二、香煙煙霧抽提物對(duì)HBE細(xì)胞BMI1水平的影響
分別用0或20μg/m
5、L CSE急性處理HBE細(xì)胞0、6、12或24 h后,或慢性處理HBE細(xì)胞0、20、30或40代后,Western blot檢測(cè)細(xì)胞BMI1水平。以觀察CSE對(duì)HBE細(xì)胞BMI1水平的影響。
三、CCAT1調(diào)控miR-218水平對(duì)香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞BMI1水平升高的影響
分別將pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl與miR-218 mimic/Con mimic共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后,或用用100
6、ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后,或用50 nM miR-218 mimic或Con mimic轉(zhuǎn)染預(yù)處理HBE細(xì)胞24 h后,再使用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h,用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度;qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞CCAT1水平和miR-218的水平;Western blot檢測(cè)HBE細(xì)胞BMI1的水平。分別用100 ppm CCAT1 siRNA/Cons
7、iRNA與miR-218 inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞24 h后,再分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h,利用Westem blot檢測(cè)HBE細(xì)胞BMI1水平。以觀察C CAT1調(diào)控miR-218水平對(duì)CSE所致HBE細(xì)胞BMI1水平的影響。
四、CCAT1通過(guò)miR-218調(diào)控BMI1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
分別用100 ppm CCA
8、T1 siRNA/Con siRNA與miR-218 inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染處理由CSE慢性處理所致惡性轉(zhuǎn)化HBE細(xì)胞(T-HBE),或分別用50nMBMI1 siRNA或Con siRNA轉(zhuǎn)染處理T-HBE細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-218的水平,Westem blot檢測(cè)細(xì)胞BMI1水平,軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞惡性程度,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲遷移能力。以觀察CCAT1通過(guò)miR-
9、218調(diào)控BMI1對(duì)CSE所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
五、香煙煙霧抽提物對(duì)HBE細(xì)胞c-Myc水平的影響
分別用0或20μg/mL CSE急性處理HBE細(xì)胞0、6、12和24 h,或慢性處理HBE細(xì)胞0、20、30和40代后,Western blot檢測(cè)細(xì)胞c-Myc水平。以觀察CSE對(duì)HBE細(xì)胞c-Myc水平的影響。
六、c-Myc在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中的作用
分
10、別用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞后,分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h,或分別用0或20μg/mL CSE急性處理HBE細(xì)胞24 h后,Western blot檢測(cè)細(xì)胞c-Myc水平,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞CCAT1水平;ChIP實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HBE細(xì)胞c-Myc與CCAT1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況。以觀察c-Myc在CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中的作用。
七、let
11、-7c在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
將pmirGLO-c-Myc-3'UTR-WT/pmirGLO-Ctrl與let-7c mimic/Con mimic共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后,或用50 nM let-7c mimic或Con mimic轉(zhuǎn)染預(yù)處理HBE細(xì)胞24 h后,再使用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h,用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞l
12、et-7c水平,Westernblot檢測(cè)細(xì)胞c-Myc水平。以觀察let-7c在CSE所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用。
八、CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
用100 ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后,或分別將pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl與let-7c mimic/Con mimic共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后,再聯(lián)合0
13、或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h;分別用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA與let-7c inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞24 h后,再分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞CCAT1和let-7c水平,Western blot檢測(cè)HBE細(xì)胞c-Myc水平;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。以觀察CCAT1在香煙煙霧
14、抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用。
九、CCAT1通過(guò)let-7c與c-Myc相互調(diào)控在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
分別用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA與let-7c inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染或分別用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA轉(zhuǎn)染處理T-HBE細(xì)胞,Westernblot檢測(cè)T-HBE細(xì)胞c-Myc水平;
15、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察T-HBE細(xì)胞惡性程度;Transwell實(shí)驗(yàn)觀察T-HBE細(xì)胞侵襲遷移能力。以觀察CCAT1通過(guò)let-7c與c-Myc相互調(diào)控對(duì)CSE所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
結(jié)果:
一、香煙煙霧抽提物對(duì)HBE細(xì)胞lncRNA與miRNA水平的影響
結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急慢性處理引起HBE細(xì)胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR、miR-21水平升高,let-7c和miR-218
16、水平下降,說(shuō)明CSE引起HBE細(xì)胞CCAT1水平升高和miR-218和let-7c水平降低。
二、香煙煙霧抽提物對(duì)HBE細(xì)胞BMI1水平的影響
結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急性處理6h或慢性處理20代后,HBE細(xì)胞BMI1水平顯著高于處理前或同代對(duì)照組HBE細(xì)胞,并有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明CSE處理可以引起HEB細(xì)胞BMI1水平升高。
三、CCAT1調(diào)控miR-218水平對(duì)香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞
17、BMI1水平升高的影響
結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218 mimic與pGL3-CCAT1-WT共轉(zhuǎn)染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活性顯著低于單獨(dú)CSE處理組。通過(guò)siRNA下調(diào)CCAT1可阻滯CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1和BMI1水平升高及miR-218水平降低;上調(diào)miR-218可阻滯CSE所致HBE細(xì)胞BMI1水平升高;與單獨(dú)下調(diào)CCAT1聯(lián)合CSE處理組相比,同時(shí)下調(diào)CCAT1和let-7c后聯(lián)合CSE處理HBE
18、細(xì)胞組的BMI1水平顯著回升。說(shuō)明CCAT1可能通過(guò)調(diào)控miR-218的表達(dá)影響其下游BMI1的水平。
四、CCAT1通過(guò)miR-218調(diào)控BMI1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)CSE處理HBE細(xì)胞組相比,通過(guò)siRNA下調(diào)CCAT1處理T-HBE細(xì)胞miR-218水平回升,同時(shí)BMI1水平下降,細(xì)胞集落形成數(shù)以及侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于單純T-HBE細(xì)胞;而在下調(diào)CCAT1水平的基礎(chǔ)
19、上同時(shí)聯(lián)合下調(diào)miR-218處理T-HBE細(xì)胞后,BMI1水平顯著高于單獨(dú)下調(diào)CCAT1處理T-HBE細(xì)胞,細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著回升;下調(diào)BMI1后,T-HBE細(xì)胞的細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降。說(shuō)明CCAT1通過(guò)miR-218調(diào)控BMI1影響了T-HBE細(xì)胞惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
五、香煙煙霧抽提物對(duì)HBE細(xì)胞c-Myc水平的影響
結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急性處理6h或慢性處理20代
20、后,HBE細(xì)胞c-Myc水平顯著高于處理前或同代對(duì)照HBE細(xì)胞,并具有一定的時(shí)間.效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明CSE處理引起HEB細(xì)胞c-Myc水平升高。
六、c-Myc在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中的作用
結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 gg/mL CSE處理組c-Myc和CCAT1水平顯著高于對(duì)照HBE細(xì)胞,通過(guò)siRNA關(guān)閉c-Myc可阻滯20μg/mL CSE所致HBE細(xì)胞c-Myc和C CAT1水平升高;20μg/mL
21、 CSE急性處理HBE細(xì)胞后c-Myc與CCAT1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合增加。說(shuō)明c-Myc在CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中具有重要作用。
七、let-7c在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)let-7c可阻滯20μg/mL CSE所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高;let-7c mimic與pmirGLO-c-Myc-3'UTR-WT共轉(zhuǎn)染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活
22、性顯著低于單獨(dú)CSE處理組。說(shuō)明let-7c通過(guò)與c-Myc的3'-UTR區(qū)結(jié)合抑制CSE處理HBE細(xì)胞c-Myc的表達(dá)。
八、CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
結(jié)果顯示通過(guò)siRNA下調(diào)CCAT1可顯著阻滯20μg/mL CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1和c-Myc水平升高;let-7c mimic與pGL3-CCAT1-WT共轉(zhuǎn)染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活性顯著低
23、于單獨(dú)CSE處理組;CCAT1 siRNA和let-7c inhibitor聯(lián)合CSE處理組的c-Myc水平顯著高于單獨(dú)CCAT1 siRNA聯(lián)合CSE處理組,同時(shí)let-7c水平顯著下降。說(shuō)明CCAT1可能通過(guò)與let-7c結(jié)合從而引起其下游c-Myc的水平變化。
九、CCAT1通過(guò)let-7c與c-Myc相互調(diào)控在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過(guò)siRNA下調(diào)CCAT1可使T-HBE細(xì)
24、胞c-Myc水平、細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降;而在利用siRNA下調(diào)CCAT1水平的基礎(chǔ)上聯(lián)合let-7c inhibitor處理T-HBE細(xì)胞后,c-Myc水平、細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移數(shù)顯著高于單獨(dú)CCAT1 siRNA處理T-HBE細(xì)胞組。說(shuō)明CCAT1可能通過(guò)let-7c調(diào)控c-Myc影響了T-HBE細(xì)胞的惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
結(jié)論:
1、CSE引起HBE細(xì)胞CCAT1水平升高及miR-218
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