TOII樣受體4介導(dǎo)氧化型低密度脂蛋白致動脈粥樣硬化的機制研究.pdf

1、目的：
　　 (1)觀察TLR4/MAPKs通路在OX-LDL誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移中的作用;
　　 (2)觀察TLR4/NF-κΒ通路在OX-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MCP-1表達(dá)中的作用;
　　 (3)觀察ERK1/2通路對OX-LDL誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)的作用;通過上述研究探討TLR4對于OX-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型變化中的作用。
　　 方法：
　　 (1)組織貼塊法培養(yǎng)大鼠VSM

2、Cs,取4代細(xì)胞進行實驗;
　　 (2)在OX-LDL刺激下采用MTT檢測VSMCs增殖,Tramwell小室檢測VSMCs遷移;同時分別應(yīng)用TLR4中和抗體(TLR4單克隆抗體、TLR4阻斷劑)、PD98059(ERK1/2特異性抑制劑)、SB203580(p38MAPK特異性抑制劑)及SP600125(JNK特異性抑制劑)預(yù)孵育后,觀察他們對OX-LDL誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移的影響;用Westernblotting檢測O

3、X-LDL單獨刺激下及TLR4中和抗體、PD98059、SB203580預(yù)孵育后ERK1/2、p38MAPK蛋白磷酸化水平的變化;
　　 (3)OX-LDL刺激下采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈技術(shù)(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血管平滑肌細(xì)胞MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá);然后應(yīng)用PDTC(NF-κΒ特異性抑制劑)及TLR4中和抗體預(yù)孵育后觀察MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá);用Western blotting檢測OX-

4、LDL單獨刺激下及TLR4中和抗體和PDTC預(yù)孵育后核NF-κΒ蛋白表達(dá)的變化;
　　 (4)單獨OX-LDL刺激下及PD98059預(yù)孵育后RT-PCR檢測TLR4 mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)本實驗成功培養(yǎng)了大鼠VSMCs細(xì)胞;
　　 (2)OX-LDL刺激VSMCs后,MTT法測得的OD值及Transwell測得細(xì)胞數(shù)顯著高于Control組,并且呈濃度依賴性;用TLR4中和抗體預(yù)

5、孵育后,MTT OD值及Transwell測得細(xì)胞數(shù)顯著下降;用PD98059、SB203580預(yù)孵育后,MTT OD值及Transwell測得細(xì)胞數(shù)也顯著下降;而用SP600125預(yù)孵育后降低不明顯;OX-LDL刺激后ERK1/2磷酸化水平為Control組的3.3l倍,p38MAPK磷酸化水平為Control組的2.68倍;而TLR4中和抗體可以使OX-LDL誘導(dǎo)的ERK1/2和p38MAPKs的磷酸化水平下調(diào),并且呈濃度依賴性；<

6、br>　　 (3)OX-LDL可以上調(diào)VSMCs MCP-1 mRNA和其蛋白的表達(dá);用TLR4中和抗體和PDTC預(yù)孵育后MCP-1 mRNA和其蛋白的表達(dá)較單獨OX-LDL刺激情況下降低;OX-LDL可以使核NF-κΒ的表達(dá)增加;而TLR4中和抗體下調(diào)了OX-LDL誘導(dǎo)的核NF-κΒ的表達(dá);
　　 (4)OX-LDL誘導(dǎo)了VSMCsTLR4mRNA的表達(dá);而SB203580預(yù)孵育后TLR4 mRNA的表達(dá)下降。
　　

7、 結(jié)論：
　　 (1)OX-LDL是TLR4的內(nèi)源性配體;
　　 (2)OX-LDL可以誘導(dǎo)VSMCs增殖和遷移;OX-LDL通過或部分通過TLR4/ERK1/2和TLR4/p38MAPK信號通路介導(dǎo)VSMCs增殖和遷移;
　　 (3)OX-LDL可以誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá);OX-LDL通過或部分通過TLR4/NF-κΒ信號通路介導(dǎo)MCP-1的表達(dá)及TLR4 mRNA的表達(dá);
　　 (4)OX-LDL通過或