天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類(lèi)抗體在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　動(dòng)脈粥樣硬化是慢性炎癥性疾病。高脂血癥時(shí)，血漿低密度脂蛋白（LDL）進(jìn)入動(dòng)脈壁氧化成為氧化低密度脂蛋白（oxLDL），被巨噬細(xì)胞吞噬后轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。既往研究證實(shí)，天然屬性IgM亞類(lèi)抗體通過(guò)封閉oxLDL與巨噬細(xì)胞結(jié)合的表位，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的吞噬，從而降低泡沫細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。臨床研究發(fā)現(xiàn)血清高濃度脂多糖/LPS與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病密切相關(guān)，但機(jī)理尚不十分明確。
　　目前

2、還沒(méi)有關(guān)于高脂飲食飼養(yǎng)的正常小鼠是否能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類(lèi)抗體，從而能影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展；體內(nèi)或者體外應(yīng)用這些天然抗體是否有保護(hù)作用；以及在LPS血清濃度升高提高動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程中，這些天然抗體是否參與尚未見(jiàn)報(bào)道?；谝陨?，我們?cè)O(shè)計(jì)并完成了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　目的：
　　1.制備并鑒定天然屬性的抗LDL及抗oxLDLIgM亞類(lèi)抗體，為研究LDL和oxLDL及其天然抗體在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中

3、的作用奠定基礎(chǔ)。
　　2.探討天然屬性的抗oxLDLIgM亞類(lèi)抗體對(duì)巨噬細(xì)胞與oxLDL結(jié)合的影響，了解其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　3.以apoE基因敲除小鼠為研究對(duì)象，復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型，研究天然屬性抗oxLDLIgM亞類(lèi)抗體對(duì)apoE基因敲除小鼠血脂、血oxLDL和主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響。
　　4.探討脂多糖活化對(duì)巨噬細(xì)胞與oxLDL結(jié)合的影響，了解脂多糖活化對(duì)天然IgM亞類(lèi)抗體在動(dòng)脈粥樣硬化中

4、的保護(hù)作用的破壞機(jī)理，進(jìn)一步了解天然抗體在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。
　　方法：
　　1.給予飼養(yǎng)在無(wú)特殊病原體條件下Babl/c小鼠高膽固醇飲食，4周后取脾細(xì)胞直接與SP2/0細(xì)胞融合，以純化的LDL及oxLDL為抗原對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔進(jìn)行間接ELISA篩選。鑒定雜交瘤上清的免疫球蛋白亞類(lèi)、亞型，進(jìn)而采用免疫印跡、免疫沉淀法和ELISA法對(duì)獲得的抗體進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)性鑒定。
　　2.體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系；純化IgM抗

5、體3A6并將其與Na125I標(biāo)記的oxLDL作用形成免疫復(fù)合物。通過(guò)油紅O染色及細(xì)胞結(jié)合同位素標(biāo)記oxLDL，以觀察3A6對(duì)巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL吞噬的封閉作用。
　　3.18只8周齡apoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（腹腔注射PBS/2ml/周）；5G8組：（腹腔注射天然屬性抗低密度脂蛋白IgM亞類(lèi)抗體5G8/10μg/g體重，2ml/周）和3A6組（腹腔注射天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM抗體3A6/10μg/g體重，2ml/周

6、）。高脂飼料飼養(yǎng)16周后行處死，分離血清，測(cè)定血清脂質(zhì)含量及血漿oxLDL含量，小鼠原位灌注固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，對(duì)各個(gè)切面的動(dòng)脈粥樣斑塊面積進(jìn)行分析。
　　4.LPS刺激巨噬細(xì)胞后，通過(guò)油紅O染色及細(xì)胞結(jié)合同位素標(biāo)記oxLDL，觀察IgM抗體3A6在LPS活化巨噬細(xì)胞情況下對(duì)oxLDL吞噬地影響。分別利用TLR4的中和性單抗,p38MAPK阻抑劑SB203580和NF-κB阻抑劑PDTC作用及Fcα/μ受體進(jìn)行RN

7、A干擾后，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)觀察Fcα/μ受體mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.雜交瘤細(xì)胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗體通過(guò)ELISA法被篩選出來(lái)，可以與LDL或oxLDL發(fā)生高親和力結(jié)合，經(jīng)過(guò)4次克隆化，最終獲得2株穩(wěn)定分泌天然屬性抗LDL抗體，命名為5G8和2H7，及1株穩(wěn)定分泌天然屬性抗oxLDL抗體，命名為3A6，3株抗體均屬于IgM亞類(lèi)，無(wú)交叉反應(yīng)，可以滿(mǎn)足免疫印跡、免疫沉

8、淀、ELISA等實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.天然屬性抗oxLDLIgM亞類(lèi)抗體3A6，在體外試驗(yàn)中能夠抑制巨噬細(xì)胞與銅氧化的LDL的結(jié)合，從而降低泡沫細(xì)胞的形成。
　　3.apoE基因敲除小鼠高脂飼料喂養(yǎng)16周后，三組之間的各項(xiàng)血脂及oxLDL含量無(wú)明顯差異；HE染色結(jié)果顯示：三組均出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，但3A6組可顯著降低胸主動(dòng)脈斑塊面積和校正面積，與對(duì)照組和5G8組比較差異有顯著性。
　　4.3A6不能抑制脂多糖活化的巨噬

9、細(xì)胞對(duì)銅氧化的LDL的結(jié)合，并且促進(jìn)銅氧化的LDL介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的生成。我們分別利用3A6F(ab′)2、Fcα/μ受體RNA干擾或者利用不識(shí)別oxLDL的IgM抑制了oxLDL-IgM與脂多糖活化的巨噬細(xì)胞的結(jié)合，意味著Fcα/μ受體對(duì)這個(gè)過(guò)程是起作用的。同時(shí)，脂多糖促進(jìn)Fcα/μ受體的表達(dá)有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性，TLR4特異性中和抗體的封閉作用可減少LPS的作用。另外，脂多糖誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化和NF-κB65的轉(zhuǎn)位促進(jìn)了Fcα

10、/μ受體表達(dá)的上調(diào)。當(dāng)使用p38MAPK阻抑劑SB203580和NF-κB阻抑劑PDTC，可降低了Fcα/μ受體表達(dá)的上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.抗LDL及抗oxLDLIgM亞類(lèi)單抗的制備為研究天然抗體在體內(nèi)脂質(zhì)代謝和相關(guān)心腦血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的研究工具。
　　2.天然屬性抗oxLDLIgM亞類(lèi)抗體3A6降低了泡沫細(xì)胞的形成，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成有預(yù)防作用。
　　3.天然屬性抗o

11、xLDLIgM亞類(lèi)抗體3A6對(duì)apoE基因敲除小鼠血脂及血漿oxLDL含量無(wú)明顯影響；但對(duì)apoE基因敲除小鼠胸主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成有抑制作用。
　　4.3A6不能抑制脂多糖活化的巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取，并且通過(guò)其Fc段與巨噬細(xì)胞的結(jié)合而促進(jìn)了oxLDL介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的生成。脂多糖通過(guò)TLR-4受體活化了p38MAPK和NF-κB通路，并且上調(diào)了Fcα/μ受體在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)。
　　5.我們的研究結(jié)果證實(shí)了LPS濃