高密度脂蛋白對動脈粥樣硬化抵抗作用及其機制.pdf

1、血脂代謝紊亂是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)最重要的危險因素之一。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)升高可以顯著增加冠心病的發(fā)病率和死亡率，而高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein，HDL)具有抵制人類動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。因此，深入研究HDL對動脈粥樣硬化發(fā)生的抵制作用及其機制具有重要的理論意義和臨床實用價值。
　　快速、高效建立AS模型是實現(xiàn)人類

2、AS疾病深入研究的基礎，大鼠系哺乳動物，與人類有很多相似之處，易獲得，成本低，成功建立大鼠AS模型非常重要。但是，由于大鼠自身具有抗動脈粥樣硬化作用，所以，優(yōu)化大鼠AS模型方法，是完成本課題的關鍵。本研究通過改良高脂喂養(yǎng)配方，改用人冠狀動脈交換球囊有效損傷大鼠胸腹主動脈，同時給與維生素D3(VitD3)肌注進行鈣超載干預，在最短時間內成功創(chuàng)建了高脂血癥模型和典型的主動脈AS模型，同時伴有大鼠脂肪性肝病，腎病及肺炎改變。
　　本研究

3、又利用大鼠天然高血清HDL和極低LDL水平的血脂條件進行整體實驗，經(jīng)過隨機分組，觀察單純高脂喂養(yǎng)造模，單純球囊損傷造模和以及二者聯(lián)合造模對AS形成的影響，結果發(fā)現(xiàn)：大鼠先天高HDL水平在一定時限內能抵御高LDL水平的致AS作用；HDL具有促進受損血管局部三磷酸腺苷結合盒轉運子(ATP binding cassette transporte A1，ABCA1)表達和促進斑塊內膽固醇逆轉運作用，損傷及高脂干預后受損血管內膜單核細胞趨化因子-

4、1(monocytechemoattractant protein-1，MCP-1)、血管間粘附分子-1(Vascular cell adhesionmolecule-1，VCAM-1)表達明顯增強。
　　載脂蛋白-I(Apolipoprotein A-I，ApoA-I)是HDL的主要成分，本實驗利用佛波酯(Phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和氧化型低密度脂蛋白(Oxidative-lowdens

5、ity lipoprotein，ox-LDL)干預人急性單核細胞白血病細胞株(THP-1)并成功誘導其分化為泡沫細胞，體外實驗發(fā)現(xiàn)：ApoA-I促進泡沫細胞膽固醇流出和ABCA1蛋白的表達，呈時間和劑量依賴關系，而且ApoA-I具有降低泡沫細胞MCP-1、VCAM-1表達的作用。ApoA-I抗炎作用可能與ABCA1的作用相關。
　　第一部分大鼠高脂血癥模型建立和動脈粥樣硬化模型創(chuàng)建方法優(yōu)化
　　目的：探索成功快速建立大鼠高脂

6、血癥模型和AS模型的更好方法
　　方法：1.優(yōu)化高脂飼料配方，選(Sprague-Dawley，SD)大鼠16只進行AS造模，高脂喂養(yǎng)7周。另選8只SD大鼠以正?；A飼料喂養(yǎng)作為對照。高脂喂養(yǎng)前，喂養(yǎng)后3和7周，分別禁食水10h，在氯胺酮(10mg/kg體重)腹腔麻醉條件下，抽取靜脈血1ml檢測血脂。2.將AS造模組16只大鼠高脂喂養(yǎng)1w后，用人經(jīng)皮冠狀動脈腔內成形術(percutaneous transluminal coron

7、ary angioplasty，PTCA)球囊導管進行胸腹主動脈損傷，建立胸腹主動脈損傷模型。3.AS造模大鼠在高脂喂養(yǎng)前當日右下肢一次性肌注VitD360萬U/kg體重，導致大鼠鈣超載。4.取造模組術后1周胸腹主動脈做掃描電鏡和光鏡檢查，術后2周和6周取近膈段胸主動脈多聚甲醛固定，制作石蠟切片，HE染色，做組織形態(tài)學分析，同時，取術后6周造模組大鼠肝臟、肺臟和腎臟，了解脂肪沉積情況。
　　結果：1.AS造模組大鼠高脂喂養(yǎng)后，血脂

8、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均有不同程度升高，呈時間依賴性，其中以TC和LDL-C增高為著，喂養(yǎng)后7w，TC水平較喂養(yǎng)前增高10倍以上，LDL-C較喂養(yǎng)前增高達70倍。而HDL-C和甘油三酯(Triglyceride，TG)則輕度增高，高脂喂養(yǎng)后3w，HDL-C增高不明顯，7周血清HDL-C水平才明顯增高，與高脂喂養(yǎng)前相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P

9、<0.05)。2.AS造模組球囊損傷后1周，掃描電鏡觀察見大部分血管內皮細胞損傷，內膜被剝脫，血管基底膜膠原暴露，并可見散在血小板粘附在膠原表面。內皮損傷從主動脈弓下1cm至腹主動脈手術切口處，長約6cm。光鏡下觀察主動脈嚴重受損，術后2周見新生內膜纖維性斑塊形成。術后6周，見典型動脈粥樣硬化斑塊形成。3.AS造模組高脂喂養(yǎng)后7周，大鼠肝臟、肺臟和腎臟均發(fā)生肉眼可見大體形態(tài)改變，分別由紫紅色、粉紅色、褐色轉變?yōu)辄S綠色，光鏡下肺臟、肝臟和

10、腎臟均有脂肪沉積，脂肪變性和間質毛細血管淤血改變。
　　結論：1.大鼠經(jīng)改良的高脂飼料配方喂養(yǎng)7周可成功創(chuàng)建高脂血癥模型，使大鼠由以HDL-C為主的血脂成分翻轉為以LDL-C為主的血脂狀態(tài)，HDL-C/LDL-C逐漸下降，為高膽固醇血癥導致血管氧化應激損傷，啟動AS的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造條件。2.大鼠胸腹主動脈經(jīng)高脂喂養(yǎng)，鈣超載和血管內膜有效損傷6周，可成功建立大鼠動脈粥樣硬化模型。
　　第二部分大鼠高密度脂蛋白對動脈粥樣硬化的抵

11、抗及可能機制
　　目的：探討大鼠HDL對動脈粥樣硬化的抵抗及產(chǎn)生機制
　　方法：1.SD大鼠被隨機分為正常對照組、高脂喂養(yǎng)組(簡稱高脂組)、血管損傷組(簡稱損傷組)以及高脂喂養(yǎng)加血管損傷組(簡稱高脂損傷組)。高脂飼料喂養(yǎng)7周建立高脂血癥模型并動態(tài)監(jiān)測血脂變化。2.利用第一部分創(chuàng)建的大鼠胸腹主動脈PTCA球囊損傷方法進行血管損傷，3.術后2周、6周取胸主動脈近膈段做石蠟切片，HE染色，在Leica顯微鏡下采集圖像，做組織形態(tài)學

12、分析。同時做胸主動脈平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，a-SMA)、增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA)、ABCA1、MCP-1和VCAM-1的免疫組織化學分析。利用photoshop圖像處理系統(tǒng)，分析各組陽性表達區(qū)域顏色的灰度值，做半定量分析。
　　結果：1.高脂組高脂喂養(yǎng)后出現(xiàn)血脂成分明顯翻轉，術后2w和6w血清HDL-C/LDL-C

13、由高脂喂養(yǎng)前的5.50降至0.55及0.29，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，血清LDL-C也由高脂喂養(yǎng)前0.23±0.07mmol/L增至2.99±1.08mmol/L和16.77±2.59mmol/L(P<0.01)，HDL-C和TG呈輕度升高。損傷高脂組血脂發(fā)生類似變化，與高脂組相比無統(tǒng)計學差別。損傷組血脂與正常對照組相比無明顯變化，提示大鼠血脂的變化由高脂喂養(yǎng)導致，血管損傷未加重血脂的紊亂。2.術后2w，損傷組和損傷高脂組均可

14、見胸主動脈內彈力板斷裂，中膜較正常對照組明顯增厚及新生內膜形成，高脂組內膜表面光滑，與正常對照組相比無顯著性差異。術后6w，損傷組和損傷高脂組新生內膜增厚明顯，前者見明顯纖維斑塊形成，而后者則可見典型AS斑塊形成，二者管腔面積均縮小，但在內膜/中膜面積百分比(％)、管腔面積狹窄率(％)之間無統(tǒng)計學差別。高脂組內膜表面欠光滑，見炎癥細胞粘附在內膜表面，由此提示單純高脂血癥和鈣超載可引起血管內膜的氧化應激損傷和炎癥細胞粘附，內皮剝脫和血管壁

15、損傷是引起血管重塑和新生內膜形成的關鍵因素。術后6w，未見機械損傷和高脂血癥氧化應激損傷導致內膜增生和血管重塑的協(xié)同作用。3.術后2w，高脂組內膜、損傷組新生內膜a-SMA和PCNA表達均較正常對照組增強，損傷高脂組新生內膜a-SMA和PCNA表達與損傷組相比無統(tǒng)計學差異。高脂組和損傷組MCP-1，VCAM-1和ABCA1表達，均明顯高于正常對照組，均P<0.05；同時發(fā)現(xiàn)高脂損傷組MCP-1，VCAM-1和ABCA1表達顯著高于高脂組

16、和損傷組，均P<0.05；損傷組MCP-1，VCAM-1表達強于高脂組，而ABCA1表達弱于高脂組，均P<0.05。
　　結論：1.大鼠具有很高的血清HDL儲備，高脂飼料喂養(yǎng)后，盡管血清LDL-C水平很高，但HDL-C與LDL-C比率仍使大鼠動脈處于HDL保護狀態(tài)。2.高脂血癥和血管機械損傷均可促進血管炎癥發(fā)生，并且二者具有協(xié)同作用，但未發(fā)現(xiàn)在促進受損血管收縮性重塑和新生內膜增生方面的疊加作用。3.高脂因素促進ABCA1表達明顯強

17、于機械損傷，大鼠高HDL儲備抵抗AS加重的機制可能與促進受損血管ABCA1表達，促進負脂細胞膽固醇逆轉運有關。4.高表達的ABCA1和HDL可能具有抗炎作用。
　　第三部分ox-LDL誘導THP-1巨噬細胞源泡沫細胞模型的建立
　　目的：探索THP-1巨噬細胞源泡沫細胞模型創(chuàng)建的可靠方法
　　方法：1.巨噬細胞和泡沫細胞的誘導分化：THP-1細胞株接種在含有10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中置于37℃5％C

18、O2孵箱中培養(yǎng)，倍增時間為48h，THP-1呈懸浮生長。然后，以105/ml的細胞密度接種到預置蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，用50ng/ml的佛玻脂(phorbol12-myristate lipoprotein，PMA)干預THP-1細胞48h，使其由單核細胞分化為巨噬細胞。然后，再用含氧化型低密度脂蛋白(Oxidative-low density lipoprotein，ox-LDL)(50μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液干預48h，

19、使THP-1源巨噬細胞被誘導分化為泡沫細胞。2.泡沫細胞鑒定，利用油紅“O”染色和氧化酶法細胞內膽固醇含量的測定，進行泡沫細胞定性和定量分析。3.免疫熒光染色進行巨噬細胞、泡沫細胞ABCA1，MCP-1，VCAM-1測定。
　　結果：1.經(jīng)PMA(50ng/ml)干預THP-1細胞48h后，細胞由圓形懸浮狀聚集生長逐漸呈現(xiàn)出貼壁生長，形態(tài)變?yōu)槎嘟切位蜷L梭形，伸出偽足，當巨噬細胞再經(jīng)ox-LDL(50μg/ml)干預24-48h后，

20、細胞體積逐漸增大，形態(tài)變得更加不規(guī)則，胞漿內可見較多脂滴顆粒，由于細胞漿內大量脂滴，甚至，將細胞核被擠到一側，符合泡沫細胞形態(tài)特點。2.油紅“O”染色見泡沫細胞內有大量紅色顆粒狀脂滴，ox-LDL(50μg/ml)誘導組油紅“O”染色陽性細胞數(shù)量明顯高于未誘導組p<0.05。ox-LDL誘導組，細胞內膽固醇含量明顯高于未誘導組(423.17 mg/g蛋白±11.76mg/g蛋白vs226.70mg/g蛋白±10.36 mg/g蛋白，p<

21、0.05)。膽固醇脂也顯著高于未誘導組(254mg/g蛋白±16.08 mg/g蛋白vs84.86mg/g蛋白±6.23mg/g蛋白，p<0.05)，誘導組細胞內膽固醇脂與膽固醇比值達60％以上，提示泡沫細胞形成。3.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞經(jīng)ox-LDL誘導48h之后，細胞內ABCA1表達較未誘導組明顯增多，而且炎癥因子MCP-1和VCAM-1表達也呈現(xiàn)明顯增多，由此提示THP-1源巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎?，細胞膜上ABCA1的表達

22、明顯增強，同時刺激泡沫細胞發(fā)生氧化應激反應，合成炎癥因子MCP-1和VCAM-1增多。
　　結論：1.50ng/ml PMA干預THP-1細胞48h，可使單核細胞誘導分化為巨噬細胞。2.50μg/ml ox-LDL干預巨噬細胞48h，使巨噬細胞負脂并成功分化為泡沫細胞。3.負脂的泡沫細胞促進了ABCA1的表達，并促進細胞內炎癥因子MCP-1和VCAM-1的表達。
　　第四部分載脂蛋白A I對泡沫細胞膽固醇流出及MCP-1、V

23、CAM-1、ABCA1表達的影響
　　目的：探索HDL核心成分ApoAI對泡沫細胞膽固醇流出的影響以及是否對炎癥因子MCP-1、VCAM-1表達產(chǎn)生影響，從而發(fā)揮抗炎作用
　　方法：以PMA(50ng/ml)及ox-LDL(50μg/ml)誘導人THP-1使其分化為負脂的泡沫細胞。以不同濃度apoA-I(5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml)孵育泡沫細胞24 h，以及apoA-I(10μg/ml)孵育

24、泡沫細胞6 h、12 h、24 h；采用油紅O染色觀察細胞內脂滴的變化，用氧化酶法檢測細胞內總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯的含量；以apoA-I(10μg/ml)或ABCA1抗體(10μg/ml)孵育泡沫細胞24h，用免疫熒光法檢測巨噬細胞及經(jīng)apoA-I及ABCA1抗體干預前后的泡沫細胞MCP-1、VCAM-1及ABCA1的表達。
　　結果1.THP-1經(jīng)PMA和ox-LDL分別干預48小時后可以成功地被誘導為富含脂質的泡沫細胞

25、。2.apoA-I可促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇流出，減少細胞內膽固醇含量，呈濃度依賴性和時間依賴性。3.隨著apoA I于預濃度增加，THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內ABCA1 mRNA的表達變化不顯著，但蛋白表達增加，0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml apoA I干預濃度下油紅O染色陽性細胞率分別為(55±4)％與(43±9)％、(33±4)％、(28±1)％、(26±2)％。

26、4.ABCA1抗體干預可以增加THP-1巨噬細胞源泡沫細胞ABCA1蛋白的表達5.經(jīng)ox-LDL(50μg/ml)干預后，與巨噬細胞相比，泡沫細胞內MCP-1、VCAM-1及ABCA1表達均明顯增強；經(jīng)apoA I(10μg/ml)干預后，與未干預組相比泡沫細胞內MCP-1及VCAM-1表達顯著減少(P均<0.05)，而ABCA1表達明顯增加(P<0.05)；經(jīng)ABCAl抗體(10μg/ml)干預后，與未干預組相比，泡沫細胞內MCP-1