沙利度胺對人骨肉瘤細胞MG-63的體外作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，其惡性程度高，預(yù)后差，死亡率高[1,2]。在近30多年的研究中發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者經(jīng)過新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)治療，5年生存率約為70％，并無顯著變化，使骨肉瘤的治療進入了瓶頸期［7］。因此，探索治療骨肉瘤的新藥物和新方法顯得尤為必要。
　　沙利度胺最早期主要用于治療妊娠嘔吐反應(yīng)，后因其嚴重胎兒致畸作用而幾乎遭全球禁用。而近些年隨著對其藥理機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺

2、具有較明顯的抗腫瘤作用。在腫瘤治療領(lǐng)域,沙利度胺已經(jīng)成為復(fù)發(fā)和難治多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)準治療的一部分，對其他腫瘤如前列腺癌、直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌及腎細胞癌等多種實體腫瘤也被證實有一定療效[18-24]。但沙利度胺對骨肉瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有何影響，目前尚少見報道。
　　本實驗用不同濃度沙利度胺處理骨肉瘤細胞，通過體外實驗探討其抗腫瘤作用，并探究可能的凋亡通路，為沙利度胺可能應(yīng)用于骨肉瘤的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

3、　　研究目的：
　　通過體外實驗觀察沙利度胺對人骨肉瘤細胞MG-63增殖和凋亡作用的影響，并探討沙利度胺對人骨肉瘤的抗腫瘤作用和可能的相關(guān)分子機制。
　　研究方法：
　　1.CCK-8法檢測不同濃度沙利度胺對人骨肉瘤U2OS、MG-63細胞株增殖抑制的影響。
　　2.Hoechst-33258熒光染色法觀察不同濃度沙利度胺對MG-63細胞胞核的形態(tài)學(xué)影響。
　　3.流式細胞術(shù)檢測不同濃度沙利度胺作用于MG-

4、63細胞后細胞凋亡情況。
　　4.流式細胞術(shù)檢測不同濃度沙利度胺作用于MG-63細胞后細胞周期變化。
　　5.JC-1熒光染色檢測不同濃度的沙利度胺處理MG-63細胞后線粒體膜電位的變化。
　　6.DCFH-DA熒光探針檢測不同濃度的沙利度胺對MG-63細胞內(nèi)活性氧水平的影響。
　　7.蛋白免疫印跡法測定不同濃度沙利的度胺處理MG-63細胞后凋亡相關(guān)蛋白BCL2、BAX、Nf-κb和Caspase3表達變化。

5、r>　　實驗結(jié)果：
　　1.體外細胞毒性實驗結(jié)果顯示：沙利度胺能明顯的抑制人骨肉瘤細胞U2OS和MG-63的細胞活性，并呈現(xiàn)劑量-時間依賴效應(yīng)；對U2OS細胞的24h、48h和72h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為：>500μg/ml、476.13±93.3μg/ml和156.61±40.65μg/ml；沙利度胺對MG-63細胞的24h、48h和72h的IC50分別為；>500μg/ml、151.05±8.09μg/ml和94.7

6、6±10.52μg/ml。
　　2.經(jīng)Hoechst-33258染色后熒光顯微鏡下觀察細胞核顯示：與實驗組對比，空白對照組人骨肉瘤MG-63細胞胞核完整，著色均勻，熒光彌散且暗淡；而不同濃度的沙利度胺處理細胞后，染色質(zhì)凝聚皺縮，著色不規(guī)則，細胞核可呈致密濃染，或呈碎塊狀，顏色較明亮，呈現(xiàn)細胞凋亡皺縮核碎裂等典型變化，而且與沙利度胺濃度具有正相關(guān)性。
　　3.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示：沙利度胺能

7、夠誘導(dǎo)骨肉瘤細胞MG-63凋亡壞死，并且與劑量呈相關(guān)性。經(jīng)不同濃度沙利度胺（0、50,100和200μg/ml）處理 MG-63細胞后，各組凋亡率分別是(7.98±1.26)%，(10.58±1.18)%，(28.74±6.08)%和(38.00±6.40)%。
　　4.流式細胞術(shù)檢測沙利度胺處理MG-63細胞后周期變化顯示：不同濃度的沙利度胺（0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）處理骨肉瘤細胞MG-63細胞4

8、8h后，流式細胞儀檢測周期變化顯示沙利度胺能起 G0/G1期阻滯，并隨劑量增加而 G0/G1期阻滯效應(yīng)對應(yīng)升高，0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml分別為(63.68±1.76)%、(71.9±0.83)%,(73.87±1.72)%和(76.37±1.12)%；而 S期細胞比例則隨濃度增高而逐漸減少，0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml分別為(19.95±3.11)%、(15.08±3.35)%、(

9、13.53±2.96)%和(12.38±2)%，G2/M期也呈下降趨勢。
　　5.JC-1探針法檢測沙利度胺對線粒體膜電位變化結(jié)果顯示：沙利度胺能明顯降低MG-63細胞線粒體膜電位，不同濃度藥物（0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）作用MG-63細胞24h后，流式細胞儀檢測相應(yīng)沙利度胺濃度對應(yīng)線粒體膜電位降低細胞比例分別為：(4.84±0.31)%、(7.63±0.94)%,（9.57±7.63）%和（13.6

10、2±5.92)%；未受損線粒體膜電位細胞比例為：(95.17±0.31)%，（92.37±0.97）%，（90.4±2.62）%，（85.53±4.70)%。
　　6.DCFH-DA熒光探針法檢測沙利度胺對細胞內(nèi)活性氧水平結(jié)果顯示：沙利度胺在100ug/ml至400ug/ml濃度范圍作用于MG63細胞可以增加其胞內(nèi)的活性氧水平，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)（P＜0.05），沙利度胺組（100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）的

11、DCF熒光強度與正常對照組的比值分別是(1.26±0.16),(1.40±1.40)和(1.88±0.32)，而陽性對照組（ROSUP）與正常對照組的比值是(1.34±0.07)。沙利度胺高濃度組(100μg/ml至400μg/ml)與低濃度組（12.5ug/ml至-50μg/ml）活性氧水平也具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7.蛋白免疫印跡法檢測不同濃度沙利度胺作用于骨肉瘤細胞后凋亡相關(guān)蛋白BCL2、BAX、Casp

12、ase3和Nf-κb蛋白表達情況，結(jié)果顯示：與陰性對照相比，不同濃度的沙利度胺（0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）處理骨肉瘤細胞MG-63細胞48h后，骨肉瘤細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl2及Nf-κb蛋白表達水平下降，而促凋亡蛋白Caspase3和Bax表達水平逐漸升高。
　　結(jié)論：
　　沙利度胺能體外抑制骨肉瘤細胞MG-63增殖和促進凋亡，可能機制是通過提升細胞內(nèi)活性氧水平，降低線粒體膜電位，促進促凋亡蛋白