17-β雌二醇抑制脂多糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞MCP-1表達和細胞遷移.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種慢性免疫炎癥性疾病，從早期的內(nèi)皮損傷激活到末期的血栓綜合癥形成均有炎性反應(yīng)的參與。傳統(tǒng)的動脈粥樣硬化危險因素(吸煙、高血糖、高血壓或血脂異常)以及機械損傷也能通過觸發(fā)動脈壁炎癥反應(yīng)，加速動脈粥樣硬化損傷的形成。細胞因子在炎癥通路中處于核心地位，除免疫細胞之外，血管壁的主要組成成分內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞也能產(chǎn)生細胞因子，并受細胞因子調(diào)節(jié)，還能通過細胞因子介導(dǎo)，與入侵的單核細胞、T細胞、肥大細胞產(chǎn)生相互作用，引起免疫細胞的聚

2、集增加，低密度脂蛋白和細胞外基質(zhì)的沉積，引發(fā)動脈粥樣硬化損傷，且作為一種“免疫血管記憶”，不斷加劇這一動脈粥樣硬化損傷過程。流行病學(xué)調(diào)查顯示去除其他致動脈粥樣硬化的危險因素的影響，單獨的慢性炎癥狀態(tài)如呼吸道和泌尿道革蘭氏陰性菌感染也會增加動脈粥樣硬化的發(fā)生率。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁中對熱抵抗、并且只有當細菌崩解后才釋放出來的非蛋白質(zhì)成分，能強烈誘發(fā)炎癥反應(yīng)，即使健康人群的血清中也可檢測到

3、LPS的存在。流行病學(xué)調(diào)查顯示血清中LPS濃度高于50pg/mL的受試者發(fā)生動脈粥樣硬化的危險較低于平均水平(14.3pg/ml)者高3倍，動物實驗也表明長期慢性低劑量注射LPS增大高脂血癥家兔，載脂蛋白-E(apolipoprotein-E，apo-E)缺陷小鼠動脈粥樣硬化損傷面積，提示LPS促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，LPS能促進粘附分子、白細胞介素、趨化因子等多種炎癥因子的表達，這些炎癥因子的表達能促進免疫細胞與血管壁細胞的相互作

4、用，促進動脈粥樣硬化損傷的進展。雌激素具有抗動脈粥樣硬化的效應(yīng)，其抗動脈粥樣硬化的機制與多種因素有關(guān)，近年來的研究顯示，其抗動脈粥樣硬化的機制與抑制炎癥反應(yīng)，尤其是抑制炎癥因子的表達有關(guān)。去勢動物會處于輕微的炎癥狀態(tài)，補充雌激素治療能改善這一狀態(tài)，表現(xiàn)為包括MCP-1在內(nèi)的一系列細胞因子表達的降低。絕經(jīng)后婦女給與激素替代治療也能降低MCP-1等眾多炎癥因子，提示雌激素可能通過抑制炎癥反應(yīng)，對抗動脈粥樣硬化損傷。
　　 單核細胞趨

5、化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子CC家族的成員，能吸引單核細胞向炎癥部位聚集，通過吸引單核細胞轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮下，轉(zhuǎn)化為巨噬細胞吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?，形成并擴大動脈粥樣硬化損傷，在始動和促進動脈粥樣硬化的發(fā)展中有重要作用。對人群動脈粥樣硬化源性的周圍動脈疾病以及冠心病進行的病例對照研究顯示，MCP-1的表達隨動脈粥樣硬化程度的增加而升高，是心血管疾病的獨立危險因素。正常

6、血管幾乎檢測不到MCP-1，在人和動物的動脈粥樣斑塊則出現(xiàn)高表達。ox-LDL、同型半胱氨酸等促進AS的介質(zhì)都能刺激血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞MCP-1的生成，介導(dǎo)動脈粥樣硬化的早期損傷并作用于動脈粥樣硬化的始終。多項研究表明抑制MCP-1，能降低動脈粥樣硬化損傷。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是動脈中層的主要成分，其遷移和過度增殖以及由此引起的大量的細胞外基質(zhì)合成是動脈粥樣硬化、高血壓

7、和經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)后管腔狹窄等多種心血管疾病的形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，過程復(fù)雜，受多種因素的調(diào)節(jié)，炎癥因素在其中起了重要的中介作用，免疫組織化學(xué)和原位雜交方法顯示，在AS的早期病變中，中膜平滑肌就能合成MCP-1，并且在AS的各個時期SMC都可通過分泌MCP-1而引起血液單核細胞遷移至血管壁，促進動脈粥樣硬化損傷的形成，抑制MCP-1或阻斷其受體CCR2能抑制血管中層平滑肌細胞增殖遷移，研究雌激素對于VSMC的MCP-1表達的影響及

8、產(chǎn)生的機制，對于抑制動脈粥樣硬化的進展有一定意義。本研究擬采用siRNA干擾技術(shù)、免疫印跡檢測、免疫熒光檢測、酶聯(lián)免疫吸附檢測等分子生物學(xué)手段，從細胞和分子水平觀察17β-雌二醇(E2)對LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMC)MCP-1表達和細胞遷移的影響，并對與之相關(guān)的信號通路進行探討，從而為雌激素抑制動脈粥樣硬化的機制提供新的資料，也為臨床治療動脈粥樣硬化提供新的作用靶點。
　　 本研究分為兩個部分，第一部分：從細胞和分子水

9、平探討E2對LPS誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞MCP-1表達和細胞遷移的影響及cav-1蛋白、p38MAPK、NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達和細胞遷移中的作用。劃痕法測定大鼠VSMC遷移距離結(jié)果表明，應(yīng)用LPS24小時后促進大鼠血管平滑肌細胞遷移，較對照組遷移距離增加；E2預(yù)孵育24小時抑制LPS誘導(dǎo)的平滑肌細胞遷移距離增加；使用MCP-1的中和劑anti-MCP-1 antibody可以降低LPS誘導(dǎo)的細胞遷移距離增加，提示L

10、PS誘導(dǎo)的細胞遷移距離增加與MCP-1的表達有關(guān)。E2與MCP-1的中和劑anti-MCP-1antibody聯(lián)合使用，并未增強anti-MCP-1antibody的作用，表明E2對LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞遷移距離增加的抑制主要與MCP-1相關(guān)。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液MCP-1的表達顯示：LPS能以時間和濃度依賴的方式促進MCP-1的表達，隨著LPS濃度的增加(0.01-10μg/m1)，MCP-1的產(chǎn)生增加，LPS作用6小時即

11、可引起MCP-1表達的升高，24小時達高峰，之后有所下降，最高可達對照組6倍以上；17β-雌二醇抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達：10-9mol/L至10-6mol/L17β-雌二醇預(yù)孵育24小時，可以明顯抑制VSMC上MCP-1的生成，抑制率分別為49.5％，46.6％，43.3％，39.1％；10-8mol/L17β-雌二醇預(yù)孵育12h，24h，48h也能抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1的生成，抑制率分別為36.3％，40.1％，43.2％

12、，表明17β-雌二醇通過抑制MCP-1的表達抑制平滑肌細胞遷移。使用信號通路阻斷劑對LPS誘導(dǎo)MCP-1生成的機制研究表明：以β-MCD破壞caveolae的結(jié)構(gòu)，降低cav-1的表達；使用p38MAPK磷酸化的抑制劑SB203580，抑制p38MAPK的磷酸化；使用PDTC抑制NF-κB激活均能抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達，抑制率分別達到46.1％，51.5％，54.5％。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)在血管平滑肌細胞分別轉(zhuǎn)染cav-1 s

13、iRNA抑制cav-1表達、NF-κBp65 siRNA抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活、p38MAPK siRNA抑制p38MAPK的磷酸化，也同樣抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達，抑制率為48.6％，52.5％，55.8％，提示cav-1蛋白、p38MAPK通路、NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達，以及由MCP-1增加所引起的血管平滑肌細胞遷移中有重要作用。
　　 第二部分：探討cav-1蛋白、p38MAPK、NF-κB通路在1

14、7β-雌二醇抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達和細胞遷移中的作用。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)及免疫印跡法檢測蛋白表達情況顯示，與第一部分抑制cav-1蛋白表達、抑制p38MAPK磷酸化、抑制NF-κB的激活，能抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達的結(jié)果一致，LPS誘導(dǎo)cav-1蛋白表達的升高、促進p38MAPK的磷酸化以及NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位激活。用雌激素受體拮抗劑ICI182780阻斷17β-雌二醇的效應(yīng)，能逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對LPS誘導(dǎo)的ca

15、y-1蛋白表達的升高、p38MAPK的磷酸化以及NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位激活的抑制，雌激素受體α的選擇性激動劑PPT能模擬17β-雌二醇的效應(yīng)，雌激素受體β的選擇性激動劑DPN則不能，提示17β-雌二醇能通過與其受體結(jié)合抑制p38MAPK磷酸化、NF-κB的核轉(zhuǎn)位激活以及cav-1蛋白的表達，抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1的生成的，雌激素受體α起主要作用。其中p38MAPK的磷酸化介導(dǎo)NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位激活，而cav-1蛋白的表達又是

16、NF-κB依賴的。
　　 綜上所述，本研究以LPS誘導(dǎo)血管平滑肌細胞的炎癥損傷，觀察17β-雌二醇對LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達和血管平滑肌細胞遷移的影響，并探討這一影響存在的內(nèi)在機制。結(jié)果表明：LPS可誘導(dǎo)血管平滑肌細胞MCP-1的表達，并通過MCP-1的表達促進血管平滑肌細胞的遷移；17β-雌二醇可抑制LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞遷移，這一抑制作用與抑制MCP-1的產(chǎn)生有關(guān)；17β-雌二醇在血管平滑肌細胞上所顯示的對抗LPS誘導(dǎo)