含人端粒酶RNA突變體的端粒酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的： 端粒酶是由催化蛋白亞基和RNA亞基組成的逆轉(zhuǎn)錄酶，它能夠以其自身的RNA作為模板，補(bǔ)充端粒末端在DNA復(fù)制過程中丟失的序列。在正常體細(xì)胞中端粒隨著細(xì)胞的分裂而不斷縮短其長(zhǎng)度直至一臨界值可致該細(xì)胞衰老甚至死亡。相反，在85%以上的腫瘤細(xì)胞中端粒酶都有表達(dá)，其對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖有著重要的作用。因此，以端粒酶為靶點(diǎn)篩選端粒酶特異抑制劑是近年來尋找新抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)。目前，還沒有端粒酶抑制劑特異的篩選模型。本課題組設(shè)計(jì)

2、了端粒酶主要成分即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）和起模板作用的端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTR）相互作用的酵母三雜交模型。 酵母的轉(zhuǎn)錄因子2個(gè)功能部分LexA（DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）和Gal4-AD（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）被人為分開，其中LexA通過MS2衣殼蛋白與hTR連接（誘餌，bait），Gal4-AD與hTERT連接（獵物，prey）。

3、由于hTR與hTERT可特異性結(jié)合，使酵母的轉(zhuǎn)錄因子的2個(gè)功能部分相互靠攏而啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。但當(dāng)hTR與hTERT之間存在抑制hTR與hTERT結(jié)合的因素時(shí)（Inhibitors，Is），報(bào)告基因不表達(dá)。通過選擇性培養(yǎng)酵母，就可以篩選抑制hTR與hTERT特異結(jié)合的抑制劑。 由于hTR中若干序列會(huì)影響RNA的正常轉(zhuǎn)錄故本課題組對(duì)其進(jìn)行基因突變并構(gòu)建含人端粒酶RNA突變體的酵母三雜交誘餌質(zhì)粒，而后與含hTERT的獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

4、入宿主酵母菌，得針對(duì)端粒酶主要成分即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和起模板作用的端粒酶RNA相互作用的基于酵母三雜交系統(tǒng)的端粒酶抑制劑篩選模型。 方法： 1、端粒酶RNA（hTR）基因的定點(diǎn)突變 根據(jù)hTR的DNA序列中三處連續(xù)四個(gè)或四個(gè)以上堿基T串聯(lián)排列部分并結(jié)合突變前后雜交RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析進(jìn)行突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，確保可作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的串聯(lián)堿基T的連續(xù)性中斷并且保證突變前后的雜交RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有很大的變化，其中的MS2

5、RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)亦仍獨(dú)立存在，也就是使突變不影響MS2RNA與酵母三雜交系統(tǒng)中雜交蛋白的結(jié)構(gòu)并共同行使激活RNA聚合酶引起報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力。根據(jù)以上要求擬定在hTR基因第41、80及102位堿基運(yùn)用重疊延伸PCR法（overlappingextensionPCR，OE-PCR）進(jìn)行T→A的點(diǎn)突變。根據(jù)hTR的DNA序列及突變位點(diǎn)，按照引物設(shè)計(jì)原則，采用引物設(shè)計(jì)軟件（PrimerPremier5．0）設(shè)計(jì)引物。重疊延伸PCR單個(gè)位點(diǎn)定點(diǎn)

6、誘變需要三個(gè)PCR反應(yīng)來完成，本研究中需突變?nèi)齻€(gè)位點(diǎn)，故進(jìn)行三次循環(huán)，得突變產(chǎn)物hTRm。產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆連接轉(zhuǎn)化，菌落PCR篩選陽性克隆，小量抽提質(zhì)粒PMD18T-hTRm，送重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證突變是否成功。 2、基于酵母三雜交系統(tǒng)的端粒酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建 （1）酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2表型及自激活性的檢測(cè) 將酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2（已經(jīng)引入了pH

7、yblex/ZeoMS2質(zhì)粒的酵母菌株L40ura3）分別涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基YC-U，YC-W，YC-H，YC-UWH上并觀察其生長(zhǎng)情況來驗(yàn)證該酵母表型，并檢測(cè)其β-半乳糖苷酶活性即自激活性。 （2）人端粒酶RNA突變體酵母三雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 將PMD18T-hTRm和PRH3'質(zhì)粒進(jìn)行AvrⅡ、AatⅡ雙酶切后重組誘餌質(zhì)粒PRH3'-hTRm，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定，鑒定為成功構(gòu)建后，將該重組誘餌質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染

8、入酵母菌L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2感受態(tài)細(xì)胞中，而后涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基YC-U，YC-W，YC-H，YC-UWH上觀察其生長(zhǎng)情況，并檢測(cè)其自身毒性。 （3）3-氨基-1，2，4-三氮唑（3-Amino-1，2，4-triazole）即3-AT抗性分析 將質(zhì)粒PRH3'侗pYESTrp3，陽性對(duì)照質(zhì)粒pRH3'/IRE同pYESTrp3/IRP分別共轉(zhuǎn)染入酵母L40ura3/pHyblex/ZeoMS

9、2中，分別涂布于含不同濃度3-AT的營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基YC-H上，并觀察其生長(zhǎng)情況從而確定最大限度消除假陽性需加入的3-AT的濃度值。 （4）基于酵母三雜交系統(tǒng)的端粒酶抑制劑篩選模型的初步構(gòu)建 將獵物質(zhì)粒pYESTrp3-hTERT（1-608），pYESTrp3-hTERT（17-593），pYESTrp3-hTERT（292-608），pYESTrp3-hTERT（292-952）中的任意一個(gè)與誘餌質(zhì)粒PRH3'-hTR

10、m一一配對(duì)，采用電擊轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)入酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2中，將共轉(zhuǎn)染后的酵母菌株分別涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基YC-UZ，YC-WZ，YC-HZ，YC-UWHZ上并觀察其生長(zhǎng)情況。 （5）β-半乳糖苷酶活性分析 將營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基YC-UWHZ上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析來確定hIR與hTERT片段是否結(jié)合，并可以初步篩選陽性克隆。 （6）反復(fù)傳代排除假陽性克隆 反復(fù)傳

11、代三次，且每次傳代后均進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)。 （7）菌落PCR篩選陽性克隆 選擇上一步驟中β-半乳糖苷酶活性分析為陽性的菌落進(jìn)行菌落PCR進(jìn)一步篩選陽性克隆。100℃水浴10分鐘裂解酵母，離心取上清作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證酵母菌中是否成功轉(zhuǎn)入含hTRm的誘餌質(zhì)粒，在確證含hTRm的誘餌質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入的基礎(chǔ)上，進(jìn)行二次PCR，驗(yàn)證含hTERT片段的獵物質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)入，取兩次PCR均為陽性的酵母菌進(jìn)行保菌備用。