STZ糖尿病小鼠創(chuàng)傷難愈的轉(zhuǎn)基因治療及機制研究.pdf

1、糖尿病(DiabetesMellitus，DM)是多病因引起的慢性代謝性疾病，其主要特征是慢性高血糖，并伴隨因胰島素分泌及/或功能缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。糖尿病誘發(fā)的多種并發(fā)癥是造成糖尿病患者高致殘率和高死亡率的主要原因。其中，糖尿病性潰瘍、壞疽、局部感染等糖尿病性創(chuàng)傷難愈并發(fā)癥的出現(xiàn)與糖尿病患者皮膚組織的創(chuàng)傷愈合能力低下有直接關(guān)系；其病理學(xué)機制主要是由于嚴重的神經(jīng)病變和血管病變所導(dǎo)致的大、中血管和微血管結(jié)構(gòu)及功能異常；而其

2、分子水平機制中，一氧化氮(NO)和超氧陰離子(Supreoxide，O2·-)占了很重要的地位。 研究表明NO可參與并促進皮膚組織創(chuàng)傷恢復(fù)的整個過程，其作用表現(xiàn)在誘導(dǎo)成纖維母細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞和角質(zhì)細胞的增殖與分化、增進血管生成、參與基質(zhì)的沉積和重塑、調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合后期炎癥反應(yīng)中多種細胞因子的活性等。 一氧化氮合酶可催化NO生成反應(yīng)；在其三個同功酶中，皮膚組織主要表達的是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，并主要由eNO

3、S維持皮膚組織中NO代謝的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，增加組織或細胞中eNOS的蛋白表達水平和酶活性可提高NO水平，并促進創(chuàng)傷愈合；反之，則將導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合延遲。因此，應(yīng)用eNOS基因?qū)μ悄虿⌒詣?chuàng)傷難愈進行轉(zhuǎn)基因治療，將可以通過提高NO的水平而促進創(chuàng)傷的愈合。 活性氧類(ROS)生成過多將在細胞內(nèi)、外形成氧化應(yīng)激狀態(tài)，并通過氧化反應(yīng)破壞許多重要生物大分子(如DNA、蛋白質(zhì)、糖類和脂類)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。而超氧陰離子(O2·-)

4、則是ROS的一個重要成員；它除了自身具有ROS的特征外，還能促進多種ROS其它成員的產(chǎn)生；另外，O2·-還具有和NO迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的特性，該反應(yīng)一方面降低了組織中NO的水平，另一方面生成強氧化劑過氧化亞硝酸對組織造成進一步損傷。進一步研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境明顯刺激O2·-的生成反應(yīng)，并因此危及血管及神經(jīng)的正常功能，導(dǎo)致糖尿病皮膚創(chuàng)傷難愈的發(fā)生發(fā)展。而研究也證明減少或阻斷O2·-的產(chǎn)生或消除已生成的O2·-可顯著減輕高糖

5、血癥對血管功能的損傷。 機體內(nèi)催化O2·-生成反應(yīng)的酶很多；其中在血管內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)催化O2·-生成反應(yīng)的主要是NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶和脫耦聯(lián)eNOS等三種；而在糖尿病患者血管內(nèi)皮系統(tǒng)或高糖環(huán)境下的各種細胞中，催化O2·-生成反應(yīng)的主要是PKC依賴性的NAD(P)H氧化酶。但有關(guān)糖尿病或高糖條件下皮膚整體組織內(nèi)O2·-的生成機制尚未見報道。 超氧化物歧化酶四種同功酶中，錳超氧化物歧化酶(MnSOD)主要在線粒體內(nèi)

6、催化O2·-轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫及氧分子，從而降低O2·-的濃度。如文獻所述，線粒體氧化呼吸鏈是O2·-的主要產(chǎn)生途徑之一；因此，MnSOD對防止細胞內(nèi)O2·-濃度過高及減輕已生成O2·-對機體的危害有重要意義。而文獻也證實在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，增加MnSOD的蛋白表達和酶活性可顯著提高細胞的存活率和對氧化環(huán)境的抵抗力。因此，應(yīng)用MnSOD基因?qū)μ悄虿?chuàng)傷難愈進行轉(zhuǎn)基因治療，將可以通過降低O2·-水平而促進創(chuàng)傷的愈合。 進行本研究所在的美

7、國密執(zhí)根州立大學(xué)病理和毒理系Dr.AlexChen實驗室長期致力于轉(zhuǎn)基因治療的研究，在動物模型的制作、腺病毒制備及標本處理方面積累了豐富的經(jīng)驗，為本研究的順利進行提供了良好的借鑒。 基于以上研究資料，本研究擬在已有的工作基礎(chǔ)上達成三個目標：①建立鏈脲霉素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠模型及其創(chuàng)傷難愈模型，為轉(zhuǎn)基因治療研究奠定基礎(chǔ)；②以腺病毒為載體，將eNOS和MnSOD基因?qū)隨TZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病

8、小鼠創(chuàng)傷難愈模型，觀察轉(zhuǎn)基因?qū)?chuàng)傷愈合的治療作用，并檢測eNOS和MnSOD的蛋白表達、酶活性及NO、O2·-等一系列相關(guān)指標的變化，為糖尿病創(chuàng)傷難愈的的轉(zhuǎn)基因治療提供靶點及理論依據(jù)；③采用選擇性抑制劑、顯性-負調(diào)節(jié)蛋白等手段，研究NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶和eNOS三者在糖尿病皮膚組織O2·-產(chǎn)生機制中的地位，在分子水平上探索糖尿病病因及創(chuàng)傷難愈的形成機制，為進一步的防治工作打下基礎(chǔ)。 本文得出以下結(jié)論：①鏈脲霉素可成功