STZ-糖尿病小鼠骨骼肌組織的FFA代謝.pdf

1、目的：糖尿病骨骼肌病變是糖尿病的并發(fā)癥之一，脂肪酸代謝紊亂是糖尿病骨骼肌病變的重要影響因素。研究糖尿病狀態(tài)下骨骼肌的各種病理改變及脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化，將有助于對糖尿病骨骼肌代謝紊亂的認(rèn)識，對糖尿病骨骼肌病的防治具有重要的理論和實(shí)踐意義，并有助于尋求防治糖尿病的有效對策。 在正常骨骼肌細(xì)胞中，脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體中經(jīng)β氧化途徑進(jìn)行氧化，線粒體中脂肪酸氧化的肌型-肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(musele-carnitine

2、 palmitoyl-transferase I，M-CPT I)、脂酰輔酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase，ACOX)分別是兩途徑的限速酶，過氧化物酶體脂肪酸β氧化除了ACOX外，還涉及L-雙功能蛋白(L-bifunctional protein，LBP)和D-雙功能蛋白(D-bifunctional protein，DBP)。健康人群空腹血漿FFA濃度波動在0.1-0.5mmol/L之間，反映了機(jī)體不同組織對FFA的攝取和釋

3、放之間的平衡，如脂肪組織及肝臟對FFA的再酯化以及骨骼肌、心肌等組織對FFA的氧化利用。糖尿病時，由于胰島素絕對或相對缺乏使心肌對葡萄糖攝取、利用受損，而脂肪動員增強(qiáng)，血中脂肪酸水平升高，實(shí)驗(yàn)研究顯示，大鼠糖尿病時心肌甘油三酯水解增強(qiáng)，造成心肌脂肪酸增多，那么，小鼠糖尿病時骨骼肌中脂肪酸的含量有何變化，未見報道。在鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞中，PPARα、線粒體脂肪酸氧化的限速酶M-CP

4、T I和過氧化物酶體脂肪酸氧化的限速酶.ACOXmRNA水平及DBP、LBP表達(dá)均增加，在骨骼肌中，脂酰CoA氧化酶基因表達(dá)增強(qiáng)，表明，糖尿病時脂肪酸氧化增強(qiáng)與線粒體、過氧化物酶體脂肪酸氧化增強(qiáng)有關(guān)。那么，糖尿病時，骨骼肌細(xì)胞線粒體脂肪酸氧化的限速酶M-CPT I、過氧化物酶體中與脂肪酸氧化的有關(guān)的另兩種酶DBP、LBP表達(dá)如何，未見報道。在糖尿病時，大鼠心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生病變，骨骼肌細(xì)胞有何病理改變，未見報道。糖尿病時血漿及骨骼肌中F

5、FA普遍升高，臨床上廣泛用于高脂血癥治療的辛伐他汀(Simvastatin)，是膽固醇合成途徑中限速酶HMGCoA還原酶的抑制劑，使膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著降低，有研究顯示，辛伐他汀還可以降低甘油三酯及FFA水平，調(diào)節(jié)脂代謝。那么，糖尿病狀態(tài)下，它對血漿及骨骼肌中FFA的濃度是否有影響?未見報道。給藥后與骨骼肌脂肪酸氧化相關(guān)基因M-CPT I、DBP、LBP的表達(dá)有無變化，未見報道。 本實(shí)驗(yàn)用STZ破壞小鼠胰島的β細(xì)胞，建立

6、實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠模型，檢測正常小鼠和糖尿病小鼠血漿及骨骼肌中FFA的變化，觀察糖尿病狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，檢測糖尿病狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞線粒體、過氧化物酶體中M-CPT I、DBP、LBP的表達(dá)情況；另外，檢測給予降脂藥辛伐他汀后，血漿及骨骼肌中FFA的變化情況以及與骨骼肌脂肪酸氧化相關(guān)基因M-CPT I、DBP、LBP的變化情況，為進(jìn)一步探討糖尿病骨骼肌脂代謝紊亂的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動物分組及

7、取材將成年雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后(體重30-50g)，隨機(jī)分為正常對照組20只(A組)，STZ注射組50只(D組)。禁食12h后，糖尿病組小鼠一次性腹腔注射2％STZ(STZ臨用前用0.1M、pH4.5檸檬酸鈉緩沖液配制)150mg/kg，正常對照組小鼠腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。注射后一周，眼眶靜脈叢采血，測定禁食12h后STZ組的空腹血糖，血糖濃度大于11.1mmol/L的小鼠定為糖尿病小鼠。糖尿病小鼠在成功造模后8周末，一部

8、分給予辛伐他汀片(用生理鹽水溶解)13mg/kg/day灌胃(用藥組，C組)，連續(xù)兩周，一部分為糖尿病對照組(B組)，于10周末給予實(shí)驗(yàn)處理。實(shí)驗(yàn)動物處理前禁食12h，次日腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛(0.37g/kg)進(jìn)行麻醉，眼眶靜脈叢采血，分離血清用于血糖、血液FFA的測定；剪開腹部，，取下肢骨，剝離肌肉，用4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，取一部分骨骼肌組織，固定于4％多聚甲醛溶液中，用于臟染色，光鏡檢測。其余組織立即置于液氮中，然后

9、于-70℃保存，用于總RNA的提取及肌肉中FFA的測定。 2.血糖的測定采用葡萄糖氧化酶法試劑盒進(jìn)行血糖的測定。 3.血液及骨骼肌細(xì)胞中FFA的測定利用化學(xué)法游離脂肪酸試劑盒進(jìn)行FFA的測定。 4 光鏡檢測骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化取部分骨骼肌組織，固定于4％多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 5 mRNA表達(dá)的測定用Trigol法提取骨骼肌組織總RNA，以GAPDH作為

10、內(nèi)參照，RT-PCR法測定骨骼肌M-CPT I、DBP、LBP mPNA的相對表達(dá)量。 6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)論： 1.糖尿病時，骨骼肌中脂肪酸含量升高，脂肪酸代謝增強(qiáng)，骨骼肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生病理。 2.糖尿病時，骨骼肌脂肪酸氧化的增強(qiáng)不僅與M-CPT I mRNA的表達(dá)增