內(nèi)源性洋地黃素在血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機(jī)制的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景 洋地黃藥物作為治療充血性心力衰竭的正性肌力藥物，自William Withering首次報(bào)道從植物中提取“洋地黃”用以治療充血性心力衰竭以來，應(yīng)用于臨床已有200多年歷史，對(duì)其作用機(jī)制的的現(xiàn)代研究證實(shí)該類藥物通過抑制Na<'+>-K<'+>-ATP酶(NKA酶)活性而發(fā)揮正性肌力作用，雖然不足以解釋其治療量與中毒量30﹪的重疊這一嚴(yán)重制約了其在臨床廣泛應(yīng)用的重大難題，但迄今尚無可以替代該類藥物的新型高效低毒的強(qiáng)心藥物。

2、研究者觀察到洋地黃藥物通過與NKA酶暴露在細(xì)胞外的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合發(fā)揮強(qiáng)心作用，由此推測(cè)在體內(nèi)也應(yīng)當(dāng)有內(nèi)源性配基(Ligand)。 本博士學(xué)位論文分為四部分，第一部分建立EDLS對(duì)體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的作用模型，觀察EDLS對(duì)HUVEC生長(zhǎng)與功能的影響，初步研究其作用機(jī)制；第二部分建立雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜，構(gòu)建對(duì)照組和EDLS刺激增殖的HUVEC的蛋白質(zhì)圖譜，比較蛋白質(zhì)變化并尋找差異蛋白質(zhì)：第三部分利

3、用電噴霧一離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography electrosprayionisation mass spectrometry/mass spectrometry,(LT-ESI-MS/MS)技術(shù)、查詢數(shù)據(jù)庫，鑒定差異蛋白質(zhì)：第四部分選取感興趣的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行功能驗(yàn)證，并探討其在哇巴因作用中的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)路線圖如下：本研究主要目的、方法、結(jié)果和結(jié)論概述如下： 研究目的 研究EDLS對(duì)HUVEC生

4、長(zhǎng)的作用，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法闡述畦巴因在踟VEC作用的表達(dá)蛋白質(zhì)譜，確定靶位蛋白分子，為開辟心血管疾病治療的新途徑奠定理論基礎(chǔ)。 研究方法 1 EDLS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUvEC)，建立EDLS作用mYVEC模型，第2-4代用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：12h、24h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)又分為對(duì)照組、哇巴因組、地高辛組和Etacrynic．Acid組。檢測(cè)方法：利用四甲基偶氮唑鹽

5、微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)法觀察不同濃度、不同藥物對(duì)HUVEC生長(zhǎng)(增殖與凋亡)的影響；臺(tái)盼藍(lán)染液檢測(cè)細(xì)胞活性；形態(tài)學(xué)觀察藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附等功能的影響；透射電鏡掃描明確細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化；Caspase-3活性測(cè)定；流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞表達(dá)增殖、凋亡與壞死的不同表現(xiàn)；以期闡明EDLS對(duì)HUVEC生長(zhǎng)的作用，初步探討其作用機(jī)制。 2 EDLS刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的差異蛋白質(zhì)篩選分別選取對(duì)照組和哇巴因刺激增殖HUVEC細(xì)胞

6、，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)分離：利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)對(duì)兩組樣品的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行分離，首先應(yīng)用等電聚焦電泳(IEF)將蛋白質(zhì)在不同PH的梯度進(jìn)行分離，然后用SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)在不同分子量梯度上進(jìn)行分離；進(jìn)行凝膠染色(銀染)，用掃描儀獲取蛋白質(zhì)雙向凝膠圖譜；應(yīng)用：PDQuest軟件進(jìn)行凝膠圖像分析，尋找兩組樣品的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究哇巴因作用的靶位蛋白奠定基礎(chǔ)。 3 EDLs作用血管內(nèi)皮細(xì)胞的差異

7、表達(dá)蛋白鑒定.質(zhì)譜鑒定重復(fù)2-DE和質(zhì)譜相容性銀染，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，本實(shí)驗(yàn)使用Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ)進(jìn)行液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜。質(zhì)譜儀配置C-18反相色譜柱，流動(dòng)相(Mobile phase)A和B分別為0.1﹪溶于超純水及乙腈中的甲酸。所有測(cè)定均在正離子方式下進(jìn)行。當(dāng)進(jìn)行LC-ESI-MS/MS分析時(shí)，Microspray方式進(jìn)樣，系統(tǒng)裝備一個(gè)C18脫鹽預(yù)柱(0.15mm×120mm)。毛細(xì)管溫度為170度，毛細(xì)管電

8、壓為3000 V。串聯(lián)質(zhì)譜掃描包括一個(gè)全掃描(full MS scan)及十個(gè)串聯(lián)掃描(MS/MS scans)，搜索使用的數(shù)據(jù)庫為IPI上人的非冗余蛋白庫(IPI.HUMAN.v3.07.fasta)，SEQUEST結(jié)果過濾參數(shù)為：當(dāng)Charge+1，Xcorr≥1.9；當(dāng)Charge+2，Xcorr≥2.2；當(dāng)Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。 應(yīng)用EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)工具分析等電點(diǎn)、分子量及

9、總平均親水性，采用GO分類工具，從生物學(xué)途徑、細(xì)胞組件及分子功能三方面對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行功能分析及分類。 4 差異蛋白在EDLS作用HUVEC的表達(dá)及功能驗(yàn)證重復(fù)哇巴因作用HIJVEC模型的增殖模型，MTT測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期，caspase-3的活性測(cè)定凋亡，形態(tài)學(xué)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附功能改變，提取細(xì)胞蛋白，western blot檢測(cè)myosin regulation light chain2、profilin-

10、1、heat shock protein 60的表達(dá)，并應(yīng)用profilin-1抗體干預(yù)哇巴因培細(xì)胞體系，觀察對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。闡述檢測(cè)的差異表達(dá)蛋白在EDLS刺激HUVEC增殖中的機(jī)制。 研究結(jié)果 1 EDLS對(duì)VEC生長(zhǎng)的影響EDLS具有促進(jìn)增殖和抑制生長(zhǎng)的雙重作用，其效應(yīng)與時(shí)間和濃度相關(guān)。與空白對(duì)照組比較，低于20nmol/l哇巴因藥物濃度，培養(yǎng)時(shí)間在48小時(shí)以內(nèi)為促進(jìn)生長(zhǎng)作用，作用高峰出現(xiàn)在10nmol/l的濃度

11、作用24小時(shí)：高于50nmol/l則呈現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用，延長(zhǎng)作用時(shí)間尤為明顯。地高辛也表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的雙重作用，在低于50nmol/l的濃度時(shí)為刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，高于此濃度則為抑制生長(zhǎng)，且其抑制生長(zhǎng)作用呈現(xiàn)濃度-時(shí)間依賴性。 流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)表明EDLS促進(jìn)VEC生長(zhǎng)的影響為增殖，而其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在一定濃度范圍內(nèi)為誘發(fā)凋亡，高濃度則為凋亡與壞死并存的混合性死亡。 非固醇類Na-KATP酶抑制劑．E

12、tacrynic Acid無促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，表明EDI。S在低于10nmol/l時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用與其對(duì)Na-KATP酶活性的抑制無關(guān)。 2 構(gòu)建了穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2-DE圖譜，篩選EDLS刺激HUVEC增殖的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)兩組樣品分別進(jìn)行3次重復(fù)的2-DE實(shí)驗(yàn)，獲得6張2DE圖像，分離出的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目對(duì)照組為2792±124，哇巴因作用組為2806±153，用PDQuest軟件進(jìn)行圖像的匹配分析，平均匹配率對(duì)照組為8

13、6.5﹪，哇巴因組為87.5﹪，重復(fù)性較好。 差異蛋白點(diǎn)分析結(jié)果顯示藥物干預(yù)組與正常組蛋白點(diǎn)差異2倍以上的點(diǎn)有39個(gè)(p<0.05)，其中增殖組差異4倍以上的點(diǎn)有8個(gè)(p<0.01)。在得出的32個(gè)差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)中，哇巴因作用增高的點(diǎn)有18個(gè)，下降點(diǎn)為14個(gè)：差異5倍的蛋白點(diǎn)，表達(dá)增高者5個(gè)，降低3個(gè)。 3 質(zhì)譜鑒定分析差異蛋白點(diǎn)LTQ-ESI-TOF/TOF-MS鑒定其中具有顯著差異的蛋白點(diǎn)，網(wǎng)上蛋白質(zhì)庫搜索比對(duì)后

14、明確32個(gè)蛋白質(zhì)，涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能。 4 差異蛋白的功能驗(yàn)證應(yīng)用western blot檢測(cè)差異蛋白myosin regulation light chain2、profilin-1、heatshock protein 60在哇巴因作用叫VEC中的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果與2-DE結(jié)果吻合。 進(jìn)一步的研究表明profilin-1在哇巴因促進(jìn)增殖VEC中表達(dá)增高(p<0.01)，應(yīng)用profilin-1抗體其

15、增殖作用下降，進(jìn)一步支持了本實(shí)驗(yàn)篩選得出的哇巴因作用VEC差異蛋白是其發(fā)揮促進(jìn)VEC增殖的靶位蛋白和/或靶位蛋白，提供了具有潛在巨大價(jià)值的哇巴因作用靶分子。 結(jié)論 1 EDLS在不同的濃度與作用時(shí)間對(duì)HUVEC作用不同，既可以促進(jìn)增殖，又有誘導(dǎo)凋亡和壞死作用，在本研究中其促細(xì)胞增殖作用不依賴于對(duì)Na-K ATP酶活性的抑制。 2 EDLS促進(jìn)mYVEC增殖的差異蛋白涉及細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能蛋白，其作用途徑不只

16、傳統(tǒng)意義上Na-K．ATP．酶作用通路一條，而是通過多種機(jī)制作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，以復(fù)雜的機(jī)制影響細(xì)胞生理病理各個(gè)過程，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 3本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到的哇巴因刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的靶蛋白之一細(xì)胞骨架蛋白profilin-1在哇巴因作用通路中發(fā)揮了重要作用。 4本實(shí)驗(yàn)提供了EDLS在血管內(nèi)皮細(xì)胞作用蛋白質(zhì)表達(dá)的重要信息，為全面闡述EDLS作用分子機(jī)理提供了重要方法和新線索，為尋找新的心