乙型肝炎病毒X基因突變與疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及目的：全球約20億人感染過(guò)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有3.5億人為HBV慢性感染者，每年約有100萬(wàn)慢性感染者死亡。HBV嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。
　　 HBV基因組為長(zhǎng)約3.2kb的部分環(huán)狀雙鏈DNA，負(fù)鏈核苷酸序列至少有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架(open reading frame，ORF):S，P，C和X。其中，HBV X基因是HBV基因組內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能重疊最明顯的區(qū)域，包含增強(qiáng)子2(E

2、nh2)、C基因啟動(dòng)子、直接重復(fù)序列DRI和DR2，這些區(qū)段在HBV基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及表達(dá)中具有重要作用。HBV X基因編碼蛋白HBx包含6個(gè)區(qū)(A～F)，共154個(gè)氨基酸(amino acid，aa)。HBx是HBV基因組所編碼蛋白中唯一具有多種調(diào)控功能的蛋白質(zhì)，這種調(diào)控功能包括：激活宿主細(xì)胞和病毒自身基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控凋亡、抑制細(xì)胞中受損DNA的外切修復(fù)反應(yīng)、增強(qiáng)原癌基因的轉(zhuǎn)錄活性、激活人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、激活細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和促

3、進(jìn)肝纖維化等。HBx通過(guò)多種調(diào)控作用直接或間接地對(duì)病毒自身的復(fù)制、宿主細(xì)胞中基因的表達(dá)、細(xì)胞的凋亡與癌變等過(guò)程產(chǎn)生廣泛的影響。HBV X基因及HBx成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。
　　 慢性HBV感染有不同的臨床階段，包括無(wú)癥狀攜帶者(asymptomatic carrier,ASC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化（liver cirrhosis，LC）和肝細(xì)胞癌(hepatocellul

4、ar carcinoma,HCC)。造成HBV慢性感染者疾病不同轉(zhuǎn)歸的機(jī)制尚不明確。HBV復(fù)制是以mRNA為中間體的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，由于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能并且病毒復(fù)制活躍，結(jié)果導(dǎo)致HBV突變經(jīng)常發(fā)生。近幾年，HBV X基因與肝癌的關(guān)系研究較多，但是，HBV X基因突變與HBV慢性感染的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系，尚未見(jiàn)詳細(xì)研究報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)122例不同臨床階段的HBV慢性感染者HBV X基因序列進(jìn)行測(cè)定和比較，探討了HBV X基因突變與

5、疾病進(jìn)展的關(guān)系，并分析了HBV X基因熱點(diǎn)突變與HBV血清標(biāo)志物和HBVDNA定量之間的相關(guān)關(guān)系，為豐富HBV致病理論、判斷病情進(jìn)展和肝癌的預(yù)防提供了新思路。
　　 方法：隨機(jī)選擇122例山東籍HBV慢性感染者，其中，無(wú)癥狀攜帶者35例、慢性乙型肝炎35例、肝硬化22例和肝細(xì)胞癌30例。所有患者均空腹抽血，并制備血清。應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nested PCR)對(duì)122例HBV慢性感染者）X基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后應(yīng)用美國(guó)

6、ABI-PRISM3730型DNA自動(dòng)熒光測(cè)序儀進(jìn)行雙向序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用BioEdit7.0、Clustal W軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較。HBV標(biāo)志物和HBV DNA定量分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)進(jìn)行檢測(cè)，分析HBV X基因熱點(diǎn)突變與HBV標(biāo)志物和HBV DNA定量的關(guān)系。
　　 結(jié)果；①ASC、CHB、LC和HCC4組患者HBV X基因堿基累積突變率分別為1.06％、1.20

7、％、1.92％和2.34％，其中，HCC和LC患者均明顯高于ASC和CHB患者(p<0.05)。②HCC和LC患者HBV X基因區(qū)A1762T/G1764A雙突變、T1753C點(diǎn)突變和C1653T點(diǎn)突變發(fā)生率均明顯高于ASC和CHB患者(p<0.05)。③HCC和LC患者TI719G點(diǎn)突變發(fā)生率均明顯低于ASC和CHB患者(p<0.05)④C1485T點(diǎn)突變和A1499G點(diǎn)突變的發(fā)生率4組患者間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。⑤36例

8、HBeAg陰性患者中A1762T/G1764A雙突變、T1753C點(diǎn)突變和C1653T點(diǎn)突變的發(fā)生率(分別為83.33％、44.44％和30.56％)均明顯高于86例HBeAg陽(yáng)性患者(分別為25.58％、4.65％和3.49％，p均小于0.05)；36例HBeAg陰性患者與86例HBeAg陽(yáng)性患者TI719G點(diǎn)突變發(fā)生率（分別為41.67％和45.35％）之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.71)。⑥52例A1762T/G1764A雙突變患者

9、HBV DNA定量（6.02±1.17log copies/mL）明顯低于70例無(wú)突變患者（7.43+-0.96log copies/mL，p=O.00）；20例T1753C點(diǎn)突變患者的HBV DNA定量（4.62+-1.96log copies/mL）明顯低于102例無(wú)突變患者(6.99+-1.60logcopies/mL，p=0.00)：C1653T點(diǎn)突變和T1719G點(diǎn)突變患者（分別為14例和54例）HBV DNA定量與無(wú)突變患者

10、（分別為108例和68例）之間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.69和0.09)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HCC和LC的發(fā)生與HBV X基因突變的累積密切相關(guān)；
　　 2.A1762T/G1764A雙突變、T1753C點(diǎn)突變和C1653T點(diǎn)突變?cè)贖CC和LC形成中可能發(fā)揮了重要作用；
　　 3.T1719G突變可能降低HBV的致病作用和致癌作用；
　　 4.A1762T/G1764A雙突變、T1753C