利用AFLP和SSR鑒定蘋果砧木及SH40自然實(shí)生后代父本.pdf

1、選擇利用具有較高耐鹽能力的砧木是提高蘋果耐鹽力的關(guān)鍵，培育耐鹽力強(qiáng)的砧木是其基礎(chǔ)。培育及鑒定耐鹽砧木時(shí)，涉及到親本選擇、親本鑒定等系列問(wèn)題。本試驗(yàn)利用AFLP和SSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)蘋果生產(chǎn)中的30個(gè)重要砧木進(jìn)行了研究，以期為中國(guó)優(yōu)良砧木資源的進(jìn)一步收集和利用提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)，對(duì)耐鹽SH40自然實(shí)生后代進(jìn)行親本鑒定，既為雜交中親本的選配提供理論參考，也為后期耐鹽篩選、性狀鑒定奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下: 1.確定了適于AFLP分

2、析的蘋果基因組DNA的提取方法(改良CTAB法),其提取液成分為:基本提取液(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％CTAB)中添加1％PVP40、10mmol/L Na2S2O5和2％β-巰基乙醇等防酚抗氧化物質(zhì)。粗提后的DNA經(jīng)RNase酶除去RNA，氯仿/異戊醇抽提兩次，無(wú)水乙醇沉淀，得到了RNA去除徹底、純度高、質(zhì)量好的蘋果基因組DNA。 2.優(yōu)化了適于蘋果分析

3、的AFLP銀染技術(shù)體系:在20μL，酶切體系中，包括基因組DNA 450 ng,Msel和EcoRI的用量各為3U，酶切時(shí)間以37℃下酶切4小時(shí)為最佳；加入接頭后，37℃連接10h以上(或過(guò)夜)；連接產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；加10μL Loading buffer，95℃變性10min，立即冰??；在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析;銀染法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。 3.確立了蘋果砧木SSR反

4、應(yīng)體系:15μL，體系中，包括基因組DNA 100 ng，10×PCR Buffer(with Mg2+)1.5μL，dNTP 0.25mmol·L-1，引物0.33μmol·L-1，Taq聚合酶1.0U。 4.從64對(duì)AFLP引物組合中篩選出7對(duì)多態(tài)性高、條帶清晰、分布均勻的引物組合進(jìn)行擴(kuò)增分析，7對(duì)引物在SH40實(shí)生后代及其親本中共擴(kuò)增出條帶382條，其中多態(tài)性條帶328條，占總帶數(shù)的86.1％，采用NTSYSpc2.1進(jìn)行

5、統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)相似系數(shù)和特征帶共鑒定出81株SH40自然實(shí)生后代的父本，鑒定率達(dá)72.3％。選用其中的3對(duì)引物組合構(gòu)建了30個(gè)蘋果砧木的AFLP指紋圖譜，每對(duì)引物都能將所有砧木鑒別開(kāi)。3對(duì)引物共擴(kuò)增出199條帶，其中多態(tài)性條帶176條，多態(tài)性百分率為88.4％，12個(gè)類型具有特征帶，占砧木總數(shù)的40％。 5.從12對(duì)SSR引物中篩選2對(duì)多態(tài)性高、質(zhì)量高的引物用于擴(kuò)增分析:構(gòu)建了30個(gè)蘋果砧木的SSR指紋，采用二歧分類法可以將供試