玉米麥根酸代謝評價體系的建立及缺鐵脅迫相關(guān)代謝基因片段的克隆.pdf

1、缺鐵是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常普遍的一個產(chǎn)量限制因子,在干旱半干旱的石灰性土壤上,果樹、玉米、高粱等作物的缺鐵問題尤為嚴重。解決這一問題有兩條途徑：一是通過改良土壤營養(yǎng)狀況,改變或排除土壤障礙因子以適應(yīng)植物生長發(fā)育,如施肥、添加土壤改良劑和其他技術(shù)措施等。二是通過育種手段,改良植物的礦質(zhì)營養(yǎng)遺傳特性,使其活化被土壤吸附固定的養(yǎng)分,變固定態(tài)為可利用態(tài),從而被植物吸收利用,即挖掘植物和土壤本身固有的潛力充分利用自然資源。培育鐵營養(yǎng)高效新品種是減輕

2、缺鐵影響的有效方法,是當(dāng)前的研究熱點之一。 禾本科類植物能夠由根系分泌麥根酸類物質(zhì)(Mugineic acids,簡稱MAs),也叫植物鐵載體(Pbylosiderophores,簡稱PS)來活化土壤中難以被植物吸收利用的鐵,使之易于被植物吸收利用,從而解決自身鐵營養(yǎng)缺乏的問題。 本研究以玉米自交系為材料,對三種玉米麥根酸類物質(zhì)的測定方法進行比較,同時分析了不同玉米自交系苗期麥根酸類物質(zhì)的分泌能力和缺鐵敏感性,比較了不同

3、生育時期玉米麥根酸分泌能力的差異,研究了玉米麥根酸分泌特性的遺傳規(guī)律,建立了玉米苗期缺鐵脅迫誘導(dǎo)的cDNA文庫,并對該cDNA,文庫的近1000個克隆進行了測序分析。主要研究結(jié)果如下： 1 篩選建立了玉米麥根酸類物質(zhì)測定方法 以16種玉米自交系為材料,根據(jù)麥根酸類物質(zhì)的溶鐵特性,建立了麥根酸類物質(zhì)間接測定新方法-ICP-AES法,改良了脫氧麥根酸(DMA)的UV-HPLC直接測定法,并與傳統(tǒng)的比色法測定結(jié)果進行比較。結(jié)果

4、表明,采用ICP-AES法,以Fe2O3粉末作為活化對象,與傳統(tǒng)采用Fe(OH)3的測定結(jié)果相比,結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好,說明ICP-AES法是玉米麥根酸類物質(zhì)分泌量的一種簡單、快速的間接測定方法。改良的UV-HPLC法也具有準(zhǔn)確、高效的特點,可應(yīng)用于禾谷類作物DMA分泌量的直接測定。高效液相色譜法是PS測定的準(zhǔn)確方法,但在材料選擇時可以利用ICP-AES方法來對材料的麥根酸分泌能力進行測定。 2 建立了玉米自交系麥根酸分泌特性的評

5、價體系 以46種玉米自交系為材料,利用高效液相色譜法和等離子體法測定了苗期和穗花期缺鐵脅迫前后玉米根系的麥根酸分泌速率,評價了不同材料的麥根酸分泌能力、缺鐵敏感性和不同生育時期分泌量的變化。結(jié)果得出,在苗期缺鐵脅迫前后材料的PS分泌能力之間存在著顯著相關(guān)關(guān)系同時兩種測定方法之間存在顯著相關(guān)關(guān)系r(Fe+)=0.7149**;麥根酸分泌特性在不同發(fā)育時期存在較大差異,四葉一心期和穗花期的測定結(jié)果具有顯著的相關(guān)性r=0.9701*,

6、穗花期玉米PS分泌速率的下降程度與苗期玉米PS分泌速率之間具有顯著的對數(shù)相關(guān)關(guān)系r=0.892*;利用苗期材料的麥根酸分泌能力和缺鐵敏感性建立了麥根酸分泌特性的評價體系,以缺鐵脅迫前PS分泌速率的平均數(shù)[2.836mg/(g*per plant*3h)]和缺鐵脅迫后的PS分泌速率增加量的平均數(shù)[0.209 mg/(g*perplant*3h)]作為分界線可以將材料分為具有不同PS分泌能力和缺鐵敏感性的四種類型：HH,HL,LH,LL,其

7、中具有LH型低PS分泌速率和高缺鐵脅迫敏感性的材料是鐵營養(yǎng)高效育種的理想材料。 3 分析了玉米麥根酸代謝遺傳規(guī)律 選用八個具有不同MAs分泌能力的玉米自交系,采用半雙列雜交的試驗設(shè)計,分析了雜交后代的麥根酸分泌能力,結(jié)果表明親本麥根酸分泌特性的測定結(jié)果與材料自身GCA的相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水平,SCA效應(yīng)值最高的組合并不一定是麥根酸分泌能力最高的組合,只有組合的SCA和雙親的GCA效應(yīng)均高,才有可能獲得麥根酸分泌能力較高

8、的組合,組合的表現(xiàn)與其TCA效應(yīng)一致。玉米麥根酸類物質(zhì)的分泌特性以顯性效應(yīng)占優(yōu)勢,遺傳加性效應(yīng)相對較小,麥根酸分泌能力的遺傳模型經(jīng)檢驗證明符合加性-顯性模型,而其缺鐵敏感性的遺傳模型則不符合?？刂汽湼岱置谀芰Ρ憩F(xiàn)顯性的主效基因組不少于一組,顯性方向為減效；控制麥根酸缺鐵敏感性表現(xiàn)顯性的主效基因組數(shù)較少,顯性方向為增效,二者的主效基因組可能不相同。 4 建立了缺鐵脅迫誘導(dǎo)的抑制性扣除雜交cDNA文庫 以缺鐵脅迫前的昌7-

9、2根尖cDNA為driver cDNA,缺鐵脅迫后的昌7-2根尖cDNA為Tester cDNA;以缺鐵脅迫后的昌7-2根尖cDNA為driver cDNA,缺鐵脅迫后的鄭58根尖cDNA為Tester cDNA,進行兩組抑制性扣除雜交,獲得了與玉米缺鐵脅迫代謝和麥根酸代謝能力差異表達有關(guān)的cDNA PCR產(chǎn)物,建立了相關(guān)文庫。 5 分析了玉米缺鐵誘導(dǎo)代謝的相關(guān)基因 分析已獲得的與玉米缺鐵脅迫特異性表達的抑制性扣除雜交的

10、PCR產(chǎn)物建立的SSH文庫,其包含的片段大小為200bp-900bp。從文庫中挑取了1230個克隆進行測序,除去8％的冗余片段共得到非重復(fù)的序列203個,其中77個的Blast結(jié)果表明它們可能是新發(fā)現(xiàn)的序列,除此之外其中：9個片段(0002,0034,0039,0143,0152,0214,0355,0375,1152)可能與缺鐵脅迫后植物適應(yīng)代謝能量降低的調(diào)控有關(guān)；3個片段(0183,0232,0350)可能與細胞質(zhì)膜上鐵的還原酶有關(guān)

11、：2個片段(0061,0622)可能與植物體內(nèi)或細胞膜上鐵離子的結(jié)合蛋白有關(guān)；5個片段(0094,0155,0208,0249,0985,1055)可能與細胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運功能有關(guān),3個片段(0234,0362,0387)與氨基酸的轉(zhuǎn)運功能有關(guān),5個片段(0103,0116,0274,0382,0681)與植物的抗逆性有關(guān),2個片段(0201,1183)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。同時在所有得到片段中,0257與DNA的促旋酶有關(guān)?？赡芘c遺傳規(guī)律的減效