花生與其近緣野生種間體細(xì)胞雜交法的基礎(chǔ)研究.pdf

1、花生是重要的油料兼經(jīng)濟(jì)作物，但由于花生易受多種病蟲害以及干旱等災(zāi)害的影響，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降?；ㄉ壱吧N具有抗病、抗逆性強(qiáng)，生物產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)良等遺傳基因，但由于花生與其近緣野生種存在的種間雜交不親和等原因，嚴(yán)重限制了野生資源的有效利用。體細(xì)胞雜交法能夠克服這種雜交不親和性，使野生種的利用成為可能。而體細(xì)胞雜交法能否成功應(yīng)用依賴于高頻率植株再生體系的建立。該項(xiàng)研究首先對(duì)花生及其近緣野生種組織培養(yǎng)植株再生方法進(jìn)行研究，建立了高頻

2、率植株再生體系，在此基礎(chǔ)上對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合進(jìn)行了研究。 1.對(duì)33個(gè)花生品種(品系)的不同外植體和利用不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽分化及植株再生進(jìn)行研究，結(jié)果表明：(1)基因型對(duì)再生率有很大的影響，不同基因型的不定芽分化率有明顯差異。(2)花生不同外植體分化不定芽的頻率有很大的差異，幼葉明顯優(yōu)于上胚軸、下胚軸和子葉。(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加NAA和BAP的濃度不同對(duì)以后再分化培養(yǎng)基上不定芽分化有較大影響。(4)對(duì)花生不定芽誘導(dǎo)的條

3、件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出比較適合花生不定芽誘導(dǎo)分化及植株再生的培養(yǎng)基組合為：不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB5+1mg/LNAA+6mg/LBAP+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％瓊脂；植株再生培養(yǎng)基為MSB5+4mg/LBAP+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％瓊脂；生根培養(yǎng)基為MSB5+0.5mg/LNAA+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％瓊脂。 2.對(duì)花生

4、及其近緣野生種胚性愈傷組織和體胚誘導(dǎo)進(jìn)行研究表明：野生種胚性愈傷組織形成培養(yǎng)基為MSB5+10mg/L2,4D+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％瓊脂。栽培種胚性愈傷組織或體胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB5+15mg/L2,4D+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％瓊脂，體胚萌發(fā)及植株再生培養(yǎng)基為MSB5+4mg/LBAP+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％瓊脂。

5、 3.建立了懸浮細(xì)胞系，花生區(qū)組野生種A.chacoensis胚性愈傷組織在添加15mg/L2,4D、4mg/LAgNO3、600mg/LCH、0.5％PVP和3％蔗糖的MSB5液體培養(yǎng)基中能很好的增殖，在液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)5-6代后可形成穩(wěn)定的胚性懸浮細(xì)胞系(繼代周期為7天)。 4.對(duì)花生原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。材料在含有CellulaseONOZUKARS(纖維素酶，2.0％)和PectolyaseY-23(果膠

6、酶，0.1％)的酶液中，酶解處理6-7小時(shí)，酶解液中可觀察到大量游離原生質(zhì)體，經(jīng)純化處理后培養(yǎng)在添加1mg/LNAA和6mg/LBAP的固液雙層培養(yǎng)基中，3天后可觀察到細(xì)胞分裂，以后細(xì)胞繼續(xù)分裂。已得到8823、魯花14和白沙果等原生質(zhì)體分裂形成的愈傷組織。 5.對(duì)花生與其近緣野生種間細(xì)胞融合及培養(yǎng)方法進(jìn)行研究。將栽培種8823體胚與匍匐?yún)^(qū)組近緣野生種A.rignoii嫩莖分離的原生質(zhì)體，用PEG法融合后，在添加1mg/LNAA