磺胺二甲嘧啶單克隆抗體的制備及其免疫檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2），屬于磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)中應(yīng)用比較廣泛的一種，含有對(duì)氨基苯磺酰胺的典型結(jié)構(gòu)，SM2抑菌譜廣，見(jiàn)效快，且成本低廉，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療。SM2還有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，因此，常作為飼料添加劑在動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中長(zhǎng)期使用。
　　SM2的過(guò)度使用會(huì)造成其在動(dòng)物源性食品中大量殘留，嚴(yán)重危害人類健康，引起了世界各國(guó)廣泛的關(guān)注。因此，歐盟各國(guó)也對(duì)相關(guān)食品中的磺

2、胺類藥物的殘留制定了最高允許值，規(guī)定總量不得高于100μg/kg，單個(gè)藥物不得高于25μg/kg。日本對(duì)食品中的SAs規(guī)定不得檢出。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件規(guī)定在所有食品動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝和腎中磺胺類藥物最高殘留限量為100μg/kg，并將磺胺二甲嘧啶列為獸藥殘留監(jiān)控的重點(diǎn)。
　　目前，檢測(cè)SM2的方法有微生物法，物理化學(xué)法以及酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)等。其中微生物法檢測(cè)速度較快，但靈敏性和特異性差，物理

3、化學(xué)法則存在樣品前處理繁瑣，需要昂貴儀器及專業(yè)操作等特點(diǎn)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法具有靈敏、快速、高通量的特點(diǎn)，不需要配備昂貴的的儀器，比較適合基層大量樣本的初篩。
　　本研究采用重氮化法將磺胺二甲嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)，合成人工完全抗原及人工檢測(cè)抗原，通過(guò)紫外掃描(UV)、SDS-PAGE和紅外光譜掃描(IR)對(duì)人工合成抗原進(jìn)行鑒定，確認(rèn)偶聯(lián)成功，偶聯(lián)比分別為13∶1和10.5∶1。用制備的SM2-BSA人工完全抗原免疫BALB/c小鼠，獲得

4、了2株能穩(wěn)定分泌抗SM2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)鑒定，3A12雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價(jià)為1∶5.0×104，制備腹水的效價(jià)為1∶4.0×105;4H4雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價(jià)為1∶2.5×104，制備腹水的效價(jià)為1∶2.0×105。親和力常數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，K(3A12)=4.9×109L/moL，K(4H4)=8.3×108L/moL，兩株細(xì)胞株均具有很好的親和力。并進(jìn)一步采用阻斷ELISA測(cè)定2株細(xì)胞株的特異性

5、，3A12的IC50為1.4μg/L，4H4的IC50為1.8μg/L，特異性很好。
　　在ELISA檢測(cè)方法初步建立的過(guò)程中，我們對(duì)反應(yīng)體系中的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化。確定了抗原的包被濃度為0.25mg/mL，抗體的工作濃度為1∶2000，采用一步法代替二步法，使得反應(yīng)時(shí)間縮短為20min，在這個(gè)反應(yīng)條件下，標(biāo)準(zhǔn)品與工作抗體的最佳加入體積比例為50μL∶10μL。
　　通過(guò)體系優(yōu)化確定了矯正曲線的動(dòng)力學(xué)范圍0.5μg/L～40