刺萼龍葵種子萌發(fā)相關(guān)的甘露聚糖酶基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、刺萼龍葵是原產(chǎn)北美的有毒有害入侵雜草，由于其適應(yīng)性廣、競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)在我國(guó)許多地區(qū)擴(kuò)散定植，嚴(yán)重破壞了入侵地的生物多樣性。種子是雜草發(fā)生危害和傳播擴(kuò)散的根源，刺萼龍葵種子具有休眠特性，不利于種群的集中防控和徹底根除。為了探究刺萼龍葵種子休眠萌發(fā)的分子調(diào)控機(jī)制，本研究針對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中降解胚乳組織的關(guān)鍵酶——甘露聚糖酶，克隆了甘露聚糖酶家族的2個(gè)基因SrMAN1和SrMAN2，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)了外源激素作用下種子在浸種和萌發(fā)過(guò)程中的基因

2、表達(dá)變化，進(jìn)行了目的基因的原核表達(dá)，并采用凝膠擴(kuò)散法驗(yàn)證了重組蛋白的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　1.從刺萼龍葵中克隆得到兩個(gè)β-甘露聚糖酶相關(guān)基因，其中 SrMAN1基因全長(zhǎng)1921 bp， SrMAN2基因全長(zhǎng)3075 bp。SrMAN1基因的編碼序列為1143 bp，編碼380個(gè)氨基酸，蛋白分子量為42.9 kD，等電點(diǎn)為5.4。SrMAN2基因的編碼序列為1242 bp，編碼413個(gè)氨基酸，蛋白分子量為46.6 kD，等電

3、點(diǎn)為5.2。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，赤霉素處理下，SrMAN1和SrMAN2基因均在胚根伸長(zhǎng)約10 mm，胚軸露出約2 mm時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰。隨著種子吸水時(shí)間的延長(zhǎng)，脫落酸作用下兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量較低；而在赤霉素與清水處理下，兩個(gè)基因的表達(dá)量先升高再降低，并且赤霉素使兩個(gè)基因的表達(dá)高峰提前出現(xiàn)；赤霉素處理下，SrMAN1基因的表達(dá)高峰高于清水處理下的表達(dá)高峰，SrMAN2基因的表達(dá)高峰低于清水處理下的表達(dá)高峰。SrM

4、AN1和SrMAN2基因在刺萼龍葵種子萌發(fā)前后均有表達(dá)，其表達(dá)無(wú)顯著的組織特異性和時(shí)間特異性。赤霉素可在一定程度上影響SrMAN1和SrMAN2基因的表達(dá)，但相比于SrMAN1基因，赤霉素對(duì)SrMAN2基因的作用較弱。
　　3.成功構(gòu)建了 SrMAN1和 SrMAN2基因的重組表達(dá)載體 pET-32a-SrMAN1和pET-32a-SrMAN2，實(shí)現(xiàn)了在E. coli BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)。菌液SDS-PAGE表明，Sr