草魚呼腸孤病毒混合感染及其致細胞病變效應的蛋白組學分析.pdf

1、草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)引發(fā)草魚病毒性出血病,是危害性極大的草魚病原體。該病毒基因組由11條雙鏈RNA組成,共編碼7個結構蛋白和5個非結構蛋白。GCRV的感染使宿主細胞出現(xiàn)細胞融合、凋亡、應急顆粒產生等病理變化。
　　全長cDNA測序技術(Full-length amplification of cDNA, FLAC)是dsRNA病毒準確、高效的基因組測序方法,廣泛應用于水生呼腸孤病毒基

2、因組研究。雙向電泳和質譜鑒定相結合的蛋白組學方法是研究病毒與宿主細胞相互作用機理有效的手段。
　　本文利用FLAC技術、real-time RT-PCR、蛋白組學方法等對以下四個方面進行研究:
　　1.從江西采集的患病草魚中分離GCRV病毒,利用FLAC技術擴增得到其部分基因的全長cDNA序列,Blast比對顯示其分別與GCRV-873和GCRV-GD108同源性為99％,揭示了我國草魚主要養(yǎng)殖區(qū)存在兩株同源性較低的GCRV

3、毒株,分別命名為GCRV-JX01和GCRV-JX02;混合感染所占疫情的比例為55%,高于單一毒株感染(30%)。
　　2.通過無限稀釋法和RT-PCR分離純化兩株病毒,利用real-time RT-PCR分別比較了兩株GCRV單獨感染和混合感染時在細胞和上清中的復制效率差異。結果顯示:在細胞中,混合感染時GCRV-JX02的復制效率高于單獨感染,GCRV-JX01較單獨感染時則降低,但兩株病毒均能正常復制擴增;在上清中,兩株病

4、毒的復制效率較單獨感染時無顯著變化。鑒于兩株病毒進化關系較遠,通過魚體注射滅活疫苗,運用Dot-blot和熒光定量方法監(jiān)測病毒復制水平,證明針對其中一株病毒產生的抗體不能識別另一株病毒,即兩株病毒無免疫交叉保護。
　　3.通過雙向電泳技術鑒別宿主細胞(CIK)在GCRV-JX01感染6 h、12 h和24 h后與未感染組的蛋白表達差異點,其中選取23個表達量上調大于3倍的差異點進行質譜鑒定,并歸納了這些蛋白質發(fā)揮的生物學功能:細胞

5、骨架(31%)、細胞應激顆粒產生(9%)、信號傳導(13%)、能量代謝相關(13%)、泛素化信號通路(17%)和其它未知功能蛋白(17%)。
　　4.克隆GCRV-JX01的NS16、NS31、NS38、VP6和VP7基因,并用Western-blot技術驗證其在CIK細胞中的表達。亞細胞定位結果顯示:NS31分布于整個細胞,在特定部位高表達;NS16分布于細胞質中,在特定部位高表達;NS38、VP7和VP6均勻分布于細胞質中;單