桃拉綜合癥病毒和草魚(yú)呼腸孤病毒外殼蛋白抗體的制備與分析.pdf

1、水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重危害。桃拉綜合癥病毒(Ta ura syndrome virus,TSV)和草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)分別是感染南美白對(duì)蝦和草魚(yú)的主要病原,嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,因此展開(kāi)對(duì)這兩種水產(chǎn)動(dòng)物病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究顯得尤為必要。TSV隸屬雙順?lè)醋硬《究?Dicistroviridae),蜜蜂麻痹病毒屬(Aparavirus);其基因組大小約為10 kb,包含兩

2、個(gè)開(kāi)放性閱讀框架(ORF),ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,ORF2編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白:VP1,VP2,VP3。GC RV隸屬呼腸孤病毒科,水生呼腸孤病毒屬(Aquareov irus),其基因組共編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP7是一種結(jié)構(gòu)蛋白,由S10基因組片段編碼,與VP5蛋白形成異源二聚體進(jìn)而形成外殼蛋白層;VP7蛋白可以結(jié)合dsRNA,與病毒的細(xì)胞吸附有關(guān)。本研究對(duì)TSV結(jié)構(gòu)蛋白基因vp2、vp3進(jìn)行了克隆表達(dá),并對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白V

3、P2、VP3及 GCRV病毒外殼蛋白VP7進(jìn)行了表達(dá)純化、相應(yīng)的多克隆及單克隆抗體的抗體制備,主要內(nèi)容如下:
　　1.桃拉綜合癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因v p2、v p3的克隆表達(dá)及抗體制備
　　根據(jù)GeneBank中桃拉綜合癥病毒的全基因組序列,分別設(shè)計(jì)該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因v p2、v p3的對(duì)應(yīng)引物,提取感染TSV的南美白對(duì)蝦中的總RNA并以此為模板,利用RT-PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行了擴(kuò)增;將目的基因vp2和vp3分別克隆

4、到表達(dá)載體pET-16b-1和pGEX-4t-3質(zhì)粒中,并轉(zhuǎn)化入Escherichia coli BL21(DE3)和DH5α中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析后,分別獲得大小分別為42 kDa和48 kDa的重組蛋白VP2和VP3,且兩種目的蛋白均以包涵體形式存在。將蛋白膠上目的蛋白條帶割膠純化并作為多抗制備的免疫原獲得抗VP2血清(P-vp2)和抗VP3血清(P-vp3)。單克隆抗體的制備以合成的VP2及 VP3多肽為免疫原,

5、經(jīng)BALB/c小鼠免疫、細(xì)胞融合及克隆亞克隆篩選獲得雜交瘤細(xì)胞,對(duì)培養(yǎng)上清液純化后獲得抗VP2單克隆抗體(M-vp2)和抗VP3單克隆抗體(M-vp3)。
　　Western blot分析顯示四種均可與體外表達(dá)的蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng),且與大腸桿菌中其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。Immunodot-blot結(jié)果顯示兩種多抗血清與兩種單克隆抗體均可以從TS V感染的對(duì)蝦中檢測(cè)到 VP2蛋白和VP3蛋白;同時(shí),單克隆抗體對(duì)TSV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性

6、較多抗血清高;單克隆抗體M-vp2的效價(jià)較單克隆抗體M-vp3略高。該結(jié)果為TSV的免疫檢測(cè)方法的建立提供了技術(shù)基礎(chǔ),為實(shí)現(xiàn)TSV的免疫學(xué)防控提供了可能。
　　2.草魚(yú)呼腸孤病毒外殼蛋白VP7的表達(dá)及單克隆抗體的制備
　　將體外構(gòu)建的VP7表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,獲得重組蛋白VP7,對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示VP7蛋白以包涵體形

7、式存在。將蛋白膠上目的蛋白條帶割膠純化并作為多抗制備的免疫原獲得抗VP7血清。采用體外微量中和實(shí)驗(yàn)分析該多抗血清的中和能力。無(wú)菌取免疫小鼠脾細(xì)胞與 SP2/0瘤細(xì)胞融合,經(jīng)兩次篩選及再克隆得到12株分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)ELISA及Western blot方法篩選出最佳單抗株,獲得GCRV病毒外殼蛋白VP7單抗株,制備單克隆抗體。采用辛酸飽和硫酸銨法對(duì)小鼠腹水及細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化并鑒定該單克隆抗體的亞型。
　　微量中

8、和實(shí)驗(yàn)及病毒滴度實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該多抗血清能夠特異性中和GC R V粒子,并且能夠有效的阻止GCRV病毒的感染。ELISA及Western blot分析顯示單克隆抗體對(duì)50 TCID50 GCRV病毒的最低檢測(cè)濃度為0.737μg/ml,且對(duì)GST標(biāo)簽蛋白無(wú)交叉反應(yīng)?？贵w亞型鑒定結(jié)果顯示該單克隆抗體的亞型為IgG2b。采用該抗體分別對(duì)采自不同地區(qū)的草魚(yú)病樣進(jìn)行ELIS A檢測(cè),以RT-PCR檢測(cè)法作為對(duì)照。對(duì)采集的草魚(yú)出血病樣品的ELIS