對蝦病毒復(fù)合檢測技術(shù)的建立.pdf

1、該文綜合介紹了對蝦病毒性病原的研究現(xiàn)狀和病毒性疾病診斷技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀,同時對應(yīng)用于對蝦病毒性病原的診斷和檢測方法做對比分析.根據(jù)WSSV,TSV和HPV三種病毒病原在中國境內(nèi)流行的現(xiàn)狀,建立這三種重要的對蝦病毒復(fù)合核酸探針檢測技術(shù).分別利用點雜交和PCR-ELISA原理建立了對蝦病毒復(fù)合核酸點雜交的檢測技術(shù)和RT-PCR ELISA同時檢測WSSV,TSV和HPV的方法.并克隆TSV三個主要結(jié)構(gòu)蛋白基因,導(dǎo)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達,為后期單克隆

2、抗體的制備提供抗原.該文主要結(jié)果如下:1.復(fù)合核酸點雜交檢測技術(shù).利用不同的修飾基團(地高辛,生物素和熒光素),分別用PCR或隨機引物法標記核酸,通過點雜交,選擇不同的抗體和底物,利用在硝酸纖維素膜基質(zhì)上發(fā)生的顏色反應(yīng)來診斷病毒核酸的存在與否.分別建立了同時檢測WSSV和TSV,以及WSSV、TSV和HPV的復(fù)合點雜交檢測方法,檢測提純核酸和感染組織的靈敏度分別為10和100pg.該項檢測該技術(shù)可以節(jié)省檢測的成本和時間,為對蝦病毒性病原

3、診斷提供更簡單快捷的技術(shù).2.復(fù)合RT-PCR ELISA在RT-PCR的基礎(chǔ)上引入了固相DNA分子雜交步驟,建立復(fù)合RT-PCR ELISA同時檢測三種病毒的方法.該體系以提取組織的總核酸粗制品為模板,以通過生物素-鏈親和素橋固定在96微孔板上的寡核苷酸作捕獲探針,與經(jīng)PCR標記地高辛的檢測探針雜交,通過顏色反應(yīng)來達到檢測病毒核酸的目的,提高RT-PCR檢測樣品的特異性和核酸雜交的靈敏性.3.TSV主要結(jié)構(gòu)蛋白原核表達將TSV三個主要