泛素特異性蛋白酶USP22及其SNPs對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控作用的研究.pdf

1、USP22是人類基因組編碼的54種泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease)之一。為了證實(shí)USP22去泛素化酶活性在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，本研究用siRNA敲除HeLa細(xì)胞中的USP22，證實(shí)其可以引起細(xì)胞周期阻滯，而這種調(diào)控作用主要依賴于其去泛素化酶活性。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 在Hela細(xì)胞中用siRNA沉默泛素特異性蛋白酶USP22基因?qū)?xì)胞周期和凋亡的影響

2、r>　　目的:
　　選擇宮頸癌細(xì)胞中的HeLa細(xì)胞作用研究對(duì)象，觀察USP22對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控作用，從而為宮頸癌的治療提供幫助。
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)針對(duì)USP22基因的特異性siRNA序列。
　　2.檢測(cè)沉默USP22基因?qū)eLa細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.檢測(cè)沉默USP22基因?qū)?xì)胞周期相關(guān)的一些因子的影響。
　　結(jié)果:
　　1.USP22 siRNA對(duì)USP22基因表

3、達(dá)的影響:HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染三種USP22 siRNA及對(duì)照siRNA片段72小時(shí)后，USP22 siRNA組的mRNA水平上基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.05)。USP22 siRNA-1效果最明顯，72小時(shí)沉默效果最好。
　　2.沉默USP22基因?qū)eLa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　3.檢測(cè)USP22調(diào)控HeLa細(xì)胞周期的機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　1.USP22 siRNA-1沉默效果最佳，最佳沉默時(shí)間為7

4、2小時(shí)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果說明，USP22對(duì)HeLa細(xì)胞的凋亡不產(chǎn)生影響，USP22表達(dá)水平的下降可以引起HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯，使其停留在G1期，從而可以抑制細(xì)胞的增殖。
　　3.USP22可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞的增殖，這一作用可能是通過c-Myc/cyclin D2，BMI-1和p53的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分 泛素特異性蛋白酶USP22的去泛素化酶活性對(duì)其調(diào)控HeLa細(xì)胞周期作用的

5、影響
　　目的:
　　為了進(jìn)一步探討USP22酶活性與這一調(diào)節(jié)作用之間的關(guān)系，本部分?jǐn)M構(gòu)建失活突變體USP22(C185S)，采用本研究室建立的以Ub-Met-β-gal和pGEX-Ub52為底物的去泛素化酶活性檢測(cè)體系檢測(cè)USP22(C185S)的酶活性的變化，并檢驗(yàn)USP22失活之后對(duì)HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，以便進(jìn)一步了解USP22在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，從而為宮頸癌的治療尋找新的治療靶點(diǎn)奠定分子理論基礎(chǔ)。<

6、br>　　方法:
　　1.pGEX-USP22質(zhì)粒和pAC-T7-USP22質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　2.pGEX-USP22(C185S)突變質(zhì)粒和pAC-T7-USP22(C185S)的構(gòu)建。
　　3.采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物對(duì)野生型USP22(WT)和失活突變體USP22(C185S)進(jìn)行去泛素化酶活性分析，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描。
　　4.檢測(cè)沉默USP22基

7、因?qū)eLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)因子的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建野生型USP22及失活突變體USP22(C185S)質(zhì)粒。
　　2.檢測(cè)pGEX-USP22(C185S)和pAC-T7-USP22(C185S)對(duì)酶活性的影響。
　　3.檢測(cè)USP22去泛素化酶活性對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.檢測(cè)USP22去泛素化酶活性對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響。
　　5.檢測(cè)USP22去泛素化酶活性

8、對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的一些因子的影響:USP22(WT)可以上調(diào)BMI-1，c-Myc，cyclin D2的表達(dá)水平，下調(diào)p53表達(dá)水平。而轉(zhuǎn)染pEGFP-USP22(C185S)組，這四個(gè)因子的水平與轉(zhuǎn)染對(duì)照pEGFP-C1組沒有明顯差別，說明USP22對(duì)BMI-1，c-Myc，cyclin和p53的調(diào)控作用也是依賴于其去泛素化酶活性的。
　　結(jié)論:
　　1.USP22的活性與其調(diào)控HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)，USP22在失去活

9、性后，對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期就失去其調(diào)節(jié)功能。
　　2.USP22在失去活性后對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的因子p53，BMI-1，c-Myc，cyclin D2也不具有調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分 泛素特異性蛋白酶USP22基因錯(cuò)義突變對(duì)去泛素化酶活性的影響及意義
　　目的:
　　前面的研究證實(shí)USP22可以調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期，而這一調(diào)節(jié)作用與USP22的去泛素化酶活性密切相關(guān)。目前對(duì)于USP22的單核苷酸多態(tài)性對(duì)其活

10、性的影響還知之甚少，因此將在NCBI上檢索到的4個(gè)錯(cuò)義突變作為研究對(duì)象，研究這四個(gè)突變體對(duì)去泛素化酶活性的影響，并選擇有活性變化的突變體轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用，以便進(jìn)一步了解USP22在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.USP22(R98W), USP22(N283S), USP22(P290L)和USP22(Y513C)突變質(zhì)粒的構(gòu)建:采用本室保存的pGEX-USP22(WT)質(zhì)粒

11、為模板，定點(diǎn)突變R98W，N283S，P290L和Y513C位點(diǎn)，構(gòu)建人的pGEX-USP22(R98w), pGEX-USP22(N283S), pGEX-USP22(P290L)和pGEX-USP22(Y513C)突變質(zhì)粒和pAC-T7-USP22(R98W), pAC-T7-USP22(N283S), pAC-T7-USP22(P290L)和pAC-T7-USP22(Y513C)質(zhì)粒。
　　2.去泛素化酶活性檢測(cè):采用GST

12、-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物對(duì)四個(gè)突變體進(jìn)行去泛素化酶活性分析，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描。
　　3.檢測(cè)USP22(Y513C)對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響:將USP22(Y513C)轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期的分布情況。
　　4.檢測(cè)USP22(Y513C)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的一些因子的影響:將USP22(Y513C)轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，然后用qRT-

13、PCR的方法檢測(cè)BMI-1，c-Myc，cyclin D2及p53的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建USP22(R98W),USP22(N283S), USP22(P290L)和USP22(Y513C)突變質(zhì)粒:測(cè)序結(jié)果證實(shí)pGEX-6P-1和pAC-T7中成功插入了USP22(R98W)，USP22(N283S)，USP22(P290L)和USP22(Y513C)序列，證明突變和換載成功。
　　2.檢測(cè)USP22

14、（R98W），USP22(N283S)，USP22(P290L)和USP22(Y513C)對(duì)酶活性的影響:USP22（R98W），USP22(N283S)，USP22(P290L)突變作用于模型底物GST-Ub52和Ub-Met-β-gal模型底物的去泛素化酶活性分析的結(jié)果與野生型USP22差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，USP22(Y513C)的去泛素化酶活性分析的結(jié)果與野生型USP22相比顯著下降，在Ub-Met-β-gal模型底物活性檢測(cè)體系中

15、USP22(Y513C)完全失去了去泛素化酶活性，在GST-Ub52模型底物活性檢測(cè)體系中，USP22(Y513C)的活性也明顯下降，下降至野生型USP22的1.7％。
　　3.USP22(Y513C)對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響:將pEGFP-C1、 pGEX-USP22(WT)、pGEX-USP22(C185S)和pGEX-USP22(Y513C)分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示四組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。USP22(

16、Y513C)去泛素化酶活性的下降使其調(diào)控HeLa細(xì)胞周期的功能消失，也就進(jìn)一步說明USP22對(duì)HeLa細(xì)胞周期的調(diào)控是依賴于其去泛素化酶活性的。
　　4.USP22(Y513C)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的一些因子的影響:轉(zhuǎn)染pEGFP-USP22(Y513C)組中，這四個(gè)因子的水平與轉(zhuǎn)染對(duì)照pEGFP-C1組沒有明顯差別，進(jìn)一步說明USP22對(duì)BMI-1，c-Myc，cyclin D2和p53的調(diào)控作用是依賴于其去泛素化酶活性的。