泛素特異性蛋白酶USP15調(diào)控Ⅰ型干擾素的機制研究以及PRRSV感染細(xì)胞的泛素化蛋白質(zhì)組學(xué).pdf

1、泛素化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是指單個或多個泛素分子連接到目標(biāo)蛋白賴氨酸(Lys)殘基上的修飾過程，需要E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶以及E3泛素連接酶的共同參與。在細(xì)胞生命過程中起著重要調(diào)控作用，涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、蛋白相互作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。
　　干擾素(IFN)是宿主抗病毒感染的重要防御機制，也是當(dāng)前抗病毒天然免疫研究的重點。Ⅰ型干擾素表達(dá)異常會引發(fā)相關(guān)的免疫疾病，因此嚴(yán)格調(diào)控Ⅰ型干擾素對于維持

2、機體的免疫穩(wěn)態(tài)十分重要。泛素化作為一種熱門并且關(guān)鍵的翻譯后修飾，在干擾素產(chǎn)生及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著關(guān)鍵角色。泛素特異性蛋白酶(USPs)是家族成員數(shù)目最多的去泛素化酶(DUBs)，正受到廣泛的關(guān)注，其功能和結(jié)構(gòu)因家族成員眾多而存在多樣性。本實驗以USP15作為研究對象，深入探究其在調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號通路中的作用，為擴充USPs家族的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。
　　泛素化修飾不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多項生理功能，還參與調(diào)控多種病毒的復(fù)制與增殖過程

3、，如牛病毒性腹瀉病毒基因組有泛素和類泛素基因;輪狀病毒等利用泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)自身復(fù)制;人免疫缺陷病毒等編碼蛋白可以發(fā)生泛素化修飾;流感病毒等通過編碼具有E3泛素連接酶活性的蛋白或者其他途徑調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化修飾。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的重要病原，其免疫機制十分復(fù)雜。目前關(guān)于泛素化修飾在PRRSV感染與免疫中的作用尚不清楚。因此本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)前后泛素化

4、修飾進(jìn)行了定量分析，揭示泛素化修飾在PRRSV感染與致病性方面發(fā)揮的重要作用。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.泛素特異性蛋白酶USP15調(diào)控Ⅰ型干擾素的機制研究
　　在我們前期通過siRNA篩選調(diào)控干擾素的泛素特異性蛋白酶時，發(fā)現(xiàn)干擾USP15后可以上調(diào)ISRE啟動子活性，因此對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。干擾分子干擾內(nèi)源性USP15基因后仙臺病毒誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)（啟動子水平，mRNA水平以及蛋白水平）、IRF3和NF-κB啟動子活性

5、及磷酸化修飾、ISRE啟動子活性及干擾素刺激基因(ISGs)的表達(dá)都有明顯上調(diào)，而在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)USP15后則呈現(xiàn)顯著的抑制效果。此外，還通過觀察對干擾素高度敏感的水泡性口膜炎病毒(VSV-GFP)的增殖情況，證實超表達(dá)USP15可以顯著抑制干擾素的產(chǎn)生。進(jìn)一步的體外及體內(nèi)去泛素實驗證實USP15具有去泛素活性且活性位點是第269位C（半胱氨酸）及862位H（組氨酸）。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，USP15可以特異性去除RIG-Ⅰ K63形式偶

6、聯(lián)的多聚泛素。通過分析USP15的突變體，發(fā)現(xiàn)USP15 DUB活性位點突變后其抑制IFN-β活性的能力顯著降低但并未完全喪失，表明USP15抑制干擾素產(chǎn)生需要但不完全依賴其DUB活性。同時，還發(fā)現(xiàn)USP15可以與RIG-Ⅰ直接相互作用，并且競爭性抑制RIG-Ⅰ對IPS-1的募集，而且DUB活性位點突變的USP15突變體同樣可以通過與RIG-Ⅰ發(fā)生相互作用進(jìn)而減弱RIG-Ⅰ與IPS-1之間的結(jié)合，進(jìn)一步證實USP15可以通過不依賴去泛素

7、化活性的方式抑制干擾素產(chǎn)生。因此，USP15可以通過兩種不同的機制抑制干擾素產(chǎn)生及其信號通路:(1) USP15特異性去除RIG-Ⅰ K63形式連接的多聚泛素;(2) USP15競爭性抑制RIG-Ⅰ對IPS-1的募集作用。
　　2.PRRSV感染細(xì)胞的泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)
　　將PRRSV WUH3株感染豬原代肺泡巨噬細(xì)胞，于感染后36h收集被感染細(xì)胞，利用Label-free技術(shù)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，對

8、PRRSV感染細(xì)胞泛素化修飾的變化情況進(jìn)行檢測和分析。共鑒定出315個蛋白的431個泛素化位點修飾顯著上調(diào)，402個蛋白的552個泛素化位點修飾顯著下調(diào)。通過生物信息學(xué)技術(shù)對修飾存在顯著差異蛋白的亞細(xì)胞定位、生物學(xué)功能、KEGG代謝通路等進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)修飾顯著差異蛋白與蛋白酶體降解、蛋白定位以及能量代謝等多種生物進(jìn)程相關(guān)，并且發(fā)生泛素化修飾的motif有3種，分別為:KubXXP、RXXXXLXKub和KubQ。將PRRSV WUH3株

9、感染PAM細(xì)胞后的差異蛋白質(zhì)組學(xué)與泛素化修飾組學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，證實泛素化修飾與蛋白表達(dá)量之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)。通過對修飾存在顯著差異蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)許多蛋白與干擾素信號通路、NF-κB信號通路相關(guān)，如TRAF6、IL-1β、HMGB1、JAK1、Mx2以及ISG15等，表明泛素化修飾的改變在PRRSV調(diào)控干擾素及炎癥反應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用。同時，還發(fā)現(xiàn)PRRSV編碼的15種蛋白(nsp1β、nsp2、nsp3、nsp4、n