泛素特異性蛋白酶USP13的分子克隆和表達(dá).pdf

1、目的：蛋白質(zhì)的泛素化修飾是細(xì)胞內(nèi)的一種基本調(diào)控機(jī)制，參與調(diào)控細(xì)胞循環(huán)，DNA修復(fù)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化等多種細(xì)胞進(jìn)程。這種轉(zhuǎn)錄后修飾是一種動(dòng)態(tài)的、可逆的過(guò)程，由多種泛素結(jié)合酶和去泛素化酶調(diào)節(jié)控制。其中去泛素化酶可以特異性的去除泛素化蛋白底物上的泛素分子，從而調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程。
　　 去泛素化酶家族大約有95個(gè)成員，按結(jié)構(gòu)和功能分為五種類型，包括泛素羧基末端水解酶(UCHs)，泛素特異性蛋白酶(USPs)，含Machado-Joseph

2、結(jié)構(gòu)域的蛋白酶(MJDs)，卵巢腫瘤蛋白酶(OTUs)和JAMM Motif蛋白酶。USPs是去泛素酶家族中種類最多，結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一類，人類有54種USPs，它們的氨基酸序列都含有高度保守的結(jié)構(gòu)域：Cys，His和Asp/Asn結(jié)構(gòu)域。
　　 本課題所研究的泛素特異性蛋白酶13(USP13)屬于USPs家族，但對(duì)于USP13的功能活性和組織分布等都還沒(méi)有詳盡的研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)大鼠腦組織和人類TE-1食管癌細(xì)胞株usp13

3、基因的克隆，了解usp13在大鼠不同組織中的分布情況，建立去泛素化酶檢測(cè)體系，尋求檢測(cè)USP13去泛素化活性的最佳方法，為進(jìn)一步研究USP13的活性和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)運(yùn)用分子克隆的方法克隆usp13基因。采用TRNzol裂解法提取大鼠腦組織總RNA，采用分段擴(kuò)增的方法，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分別擴(kuò)增獲得usp13-5'和usp13-3’。將usp13基因5’和3’分別克隆

4、至pGEM-T easy載體，通過(guò)藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)確定陽(yáng)性克隆并應(yīng)用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序分析。
　　 (2)采用熒光定量PCR(Real-Time RT-PCR)2-ΔΔCt相對(duì)定量方法檢測(cè)usp13在大鼠腦組織、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、骨骼肌、脾臟和睪丸中的相對(duì)表達(dá)水平。以GAPDH基因作為內(nèi)參，將標(biāo)本間RNA的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以u(píng)sp13在腦組織中的表達(dá)水平作為校準(zhǔn)樣本，比較各組織中usp1

5、3表達(dá)水平的差異。
　　 (3)GST-USP13融合蛋白的表達(dá)首先將usp13-5’基因克隆到pGEX6p-1原核表達(dá)載體，得到pGEX-usp13-5'質(zhì)粒，然后將usp13-3’基因克隆到pGEX-usp13-5’質(zhì)粒中，最終得到pGEX-usp13質(zhì)粒。在大腸桿菌DH5α中表達(dá)，獲得120kDa左右的GST-USP13融合蛋白，同時(shí)檢測(cè)融合蛋白GST-USP13的可溶性。
　　 (4)構(gòu)建兩種去泛素化酶活性檢測(cè)體

6、系，檢測(cè)大鼠USP13去泛素化酶活性。①T7-USP13/GST-Ub52方法采用定向克隆的方法構(gòu)建pAC-T7-usp13質(zhì)粒，可表達(dá)帶有T7標(biāo)簽的T7-USP13蛋白。pAC-T7-usp13表達(dá)質(zhì)粒與標(biāo)準(zhǔn)底物(GST-Ub52)表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Ub52共轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后共表達(dá)，研究去泛素化酶的活性。以GST-Ub52做為標(biāo)準(zhǔn)底物，分子量為45kDa，去泛素化后分子量為36kDa。以去泛素化酶USP46作為

7、陽(yáng)性對(duì)照。用GSH-Sepharose-TM Resin純化蛋白系統(tǒng)純化GST融合蛋白，進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳檢測(cè)。②GST-USP/Ub-Met-β-gal方法以GST-USP13融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-usp13和表達(dá)Ub-Met-β-gal融合蛋白底物的pAC-M-β-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后共表達(dá)，用anti-β-gal抗體進(jìn)行蛋白印記分析。以USP46作為陽(yáng)性對(duì)照，用Odyssey紅外熒

8、光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。
　　 (5)運(yùn)用分子克隆的方法從人類TE-1食管癌細(xì)胞株中克隆usp13基因，采用去泛素化酶活性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)人類USP13去泛素化酶活性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)本課題從大鼠腦組織中成功克隆出泛素特異性蛋白酶usp13基因。大鼠usp13基因的編碼區(qū)由2，577個(gè)堿基組成，編碼858個(gè)氨基酸，推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量約為96kDa。USP13包含高度保守的結(jié)構(gòu)域：Cys，His和Asp區(qū)域

9、，符合泛素特異性蛋白酶的特征。
　　 (2)usp13在大鼠腦組織、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、骨骼肌、脾臟和睪丸中均有表達(dá)，其中肺臟和腎臟中的表達(dá)量略高于腦組織中的表達(dá)量，分別是腦組織中表達(dá)量的1.17和1.13倍；心臟、肝臟和脾臟中表達(dá)水平與腦組織相近，分別是其1.04、1.02和0.91倍；而在睪丸和骨骼肌中表達(dá)較少，僅為腦組織中的0.55、0.36倍。
　　 (3)表達(dá)出GST-USP13融合蛋白。含重組質(zhì)粒pGEX

10、-usp13的大腸桿菌DH5α經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，出現(xiàn)一種分子量約為120kDa的新蛋白表達(dá)，與GST（分子量為26kDa）和USP13（分子量約為96kDa）的理論分子量相符，并且37℃誘導(dǎo)4小時(shí)該融合蛋白為不溶性蛋白，在15℃經(jīng)TPTG誘導(dǎo)40小時(shí)，GST-USP13融合蛋白部分可以溶解。
　　 (4)建立兩種去泛素化酶活性檢測(cè)體系，可以成功檢測(cè)到作為陽(yáng)性對(duì)照的USP46的去泛素化酶活性，也可以檢測(cè)到USP13和特異性底物的表達(dá)

11、，但對(duì)于檢測(cè)USP13的去泛素化酶活性，兩種體系均不理想。
　　 (5)從人類TE-1食管癌細(xì)胞株中克隆出usp13基因，人類usp13的編碼區(qū)由2，592個(gè)堿基組成，編碼863個(gè)氨基酸，推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量約為97kDa。并且兩種去泛素化酶活性檢測(cè)體系對(duì)于檢測(cè)人類USP13的去泛素化酶活性同樣未得到理想結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 (1)克隆出大鼠泛素特異性蛋白酶usp13基因(GenBank accessionn