青蝦泛素特異性蛋白酶9基因(Usp9)全長cDNA克隆及時(shí)空表達(dá)分析.pdf

1、青蝦，學(xué)名日本沼蝦（Macrobrachiumnipponense），是一種廣泛分布于我國淡水水域的主要經(jīng)濟(jì)蝦類。青蝦雌雄個(gè)體之間的生物學(xué)或者經(jīng)濟(jì)性狀存在顯著差異，如性成熟的雄蝦個(gè)體明顯大于同齡的雌蝦，雄蝦的生長速度也遠(yuǎn)大于雌蝦。因此，青蝦的性別決定和性別控制研究具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和生產(chǎn)意義。有研究表明，泛素特異性蛋白酶9(ubiquitin-specificprotease9，Usp9)在褐家鼠中與X染色體連鎖，并且發(fā)現(xiàn)其在雌雄腦表達(dá)

2、有明顯的性別差異，同時(shí)該基因在神經(jīng)系統(tǒng)中參與epsin蛋白去泛素化的過程，與神經(jīng)細(xì)胞的分化和突觸的形成有關(guān)。Usp9基因的克隆和表達(dá)分析在甲殼動(dòng)物中尚未有相關(guān)報(bào)道。
　　本文從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精巢文庫中篩選到褐家鼠（Rattusnorvegicus）“泛素特異性蛋白酶9基因”的同源序列，采用快速擴(kuò)增cDNA末端(rapid-amplificationofcDNAends，RACE)技術(shù)首次克隆了青蝦“泛素特異性蛋白酶9基因”（U

3、sp9）的全長cDNA序列。該cDNA序列全長1217bp，包括978bp的開放閱讀框(ORF)、120bp的5啡編碼區(qū)(UTR)和116bp的3'UTR，并且3'端存在Poly(A)尾巴?；蚬簿幋a326個(gè)氨基酸多肽前體，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為36.53kDa，理論等電點(diǎn)PI為5.32。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Usp9的蛋白沒有信號肽及跨膜區(qū)域，表明它是在細(xì)胞核內(nèi)起作用。氨基酸序列比對分析顯示，青蝦Usp9蛋白與太平洋牡蠣（Crassostre

4、agigas）、鳳仙花熊蜂（Bombusimpatiens）及灰短尾負(fù)鼠（Monodelphisdomestica）的蛋白相似度分別為99％、97％和95％。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，青蝦Usp9基因的氨基酸序列與同屬甲殼綱的鉤額型蚤狀溞（Daphniapulex）進(jìn)化關(guān)系最近而聚為一支。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了Usp9基因的時(shí)空表達(dá)，水溫28℃時(shí)，Usp9基因在青蝦發(fā)育的后幼體發(fā)育期第五天PL5出現(xiàn)表達(dá)高峰。Usp9基因在6種成體組織中

5、均有表達(dá)，表達(dá)水平依次為:腦＞腹神經(jīng)＞精巢＞卵巢＞肌肉＞腸。而在雌雄組織差異表達(dá)分析表明，精巢中Usp9基因表達(dá)量比卵巢的比值為2.86，腦組織中雄蝦的表達(dá)量比雌蝦為2.27，差異均為極其顯著（P＜0.01）。
　　本研究首次克隆得到了青蝦Usp9基因的全長cDNA序列，對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，并首次采用熒光定量PCR技術(shù)分析了該基因在青蝦胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育和幼蝦發(fā)育的不同時(shí)期和成體組織的時(shí)空表達(dá)差異，這也是Usp9基因在甲殼動(dòng)物