泛素特異性蛋白酶USP26分子克隆及活性檢測.pdf

1、目的:泛素-蛋白酶體途徑通過蛋白質(zhì)的泛素化修飾，即泛素與靶蛋白氨基酸殘基的結(jié)合來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞周期，膜蛋白轉(zhuǎn)運，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，組蛋白功能，免疫應(yīng)答以及DNA復(fù)制和修復(fù)等多種重要進程。它對維持細(xì)胞正常的生命活動是非常重要的。然而這種蛋白修飾又是一種泛素化與去泛素化可逆、動態(tài)的過程。去泛素化酶通過負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白的泛素化，在泛素介導(dǎo)的細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。去泛素化酶(DUBs)功能失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病，包括遺傳性腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等。
　

2、　 去泛素化酶(DUBs)多屬于半胱氨酸水解酶，又可分為四個亞型:泛素特異性蛋白酶家族(USPs)、泛素C-末端水解酶家族UCH、含OTU結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸水解酶（OTU家族）以及Machado-Joseph病結(jié)構(gòu)域蛋白酶（MJD家族）。UBP家族成員眾多，并且含有Cys，His和Asp/Asn等高度保守的結(jié)構(gòu)域。本文研究的去泛素化酶USP26就是USP家族中的一種。
　　 本課題研究的泛素特異性蛋白酶26(USP26)屬于US

3、Ps超家族成員之一。有關(guān)USP26基因多態(tài)性與男性不育的關(guān)系還僅僅限于人群基因分型研究，但是受到人種、地域以及樣本量等因素的影響，這些SNP是否與男性不育相關(guān)聯(lián)還不是很清楚。本研究通過克隆人的USP26基因，并構(gòu)建野生型USP26以及6種SNP的表達質(zhì)粒，同時建立兩種去泛素化酶活性檢測體系，分析這些SNP是否對去泛素化酶活性產(chǎn)生影響，從而驗證USP26基因是否引起男性不育，為后續(xù)的進一步研究提供理論支撐。
　　 方法:
　

4、　 (1)應(yīng)用分子克隆技術(shù)克隆USP26基因。采用DNA提取試劑盒從血液中提取正常人基因組DNA，采用分段擴增的方法，運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別擴增出usp26-5'和usp26-3'。然后將基因片段usp26-5'和usp26-3'分別克隆到pGEM-Teasy載體上，采用藍(lán)白斑篩選實驗確定陽性克隆并通過堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后再測序分析。將測序正確的pGEM-T-usp26-5'和pGEM-T-usp26-3'重

5、組質(zhì)粒以pGEX-6p-1質(zhì)粒為媒介，最終得到重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-usp26。
　　 (2)GST-USP26融合蛋白的表達及可溶性鑒定將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-usp26轉(zhuǎn)化到在大腸桿菌DH5α中并通過IPTG誘導(dǎo)表達，獲得130kDa左右的GST-USP26融合蛋白，同時檢測GST-USP26融合蛋白的可溶性。
　　 (3)以重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-usp26-WT為模版，采用定點突變的方法構(gòu)建這6種

6、SNP(G170R、E192E、F348L、T659M、K734N、E749D)的重組質(zhì)粒以及C304S突變型質(zhì)粒。然后通過限制性內(nèi)切酶更換載體pACT7，從而又得到以pACT7為載體的重組質(zhì)粒，為后面的活性分析做準(zhǔn)備。
　　 (4)構(gòu)建兩種去泛素化酶活性檢測體系，檢測人野生型USP26、6種SNP以及C304S突變型去泛素化酶活性。①T7-USP/GST-Ub52方法將以pAC-T7為載體的重組質(zhì)粒，野生型USP26-WT、6

7、種SNP、C403S（無活性對照）、USP46（陽性對照）以及pAC-T7質(zhì)粒（陰性對照）分別與pGEX-Ub52重組質(zhì)粒共表達。其中pGEX-Ub52重組質(zhì)粒表達的GST-Ub52作為模型底物。經(jīng)過GSH-Sepharose-TMResin純化蛋白系統(tǒng)純化GST融合蛋白，然后進行10％SDS-PAGE電泳檢測?？蓪?5kDa底物蛋白切斷生成36kDa蛋白產(chǎn)物，即為去泛素化酶活性陽性，否則為陰性，而且通過兩者的比例判斷活性的大小。②GS

8、T-USP/Ub-Met-β-gal方法將以pGEX-6p-1為載體的重組質(zhì)粒，野生型USP26-WT、6種SNP、C403S（無活性對照）、USP46（陽性對照）以及pGEX-6p-1質(zhì)粒（陰性對照）分別與pAC-ub-β-gal重組質(zhì)粒共表達。其中pAC-ub-β-gal重組質(zhì)粒表達的Ub-Met-β-gal為模型底物。用小鼠抗β-gal單克隆抗體檢測底物Ub-Met-β-gal的表達情況，應(yīng)用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行

9、分析。Ub-Met-β-gal底物蛋白被切斷成低分子量的Met-β-gal蛋白，即去泛素化酶活性陽性，兩者比例判斷活性大小。
　　 結(jié)果:
　　 (1)從人血液中克隆出泛素特異性蛋白酶USP26編碼基因，全長2742bp。
　　 (2)構(gòu)建出USP266種SNP重組質(zhì)粒pGEX-usp26-G170R、pGEX-usp26-E192E、pGEX-usp26-F348L、pGEX-usp26-T659M、pGEX-

10、usp26-K734N、pGEX-usp26-E749D以及無活性突變質(zhì)粒pGEX-usp26-C304S。經(jīng)酶切鑒定及測序驗證均正確。
　　 (3)表達出分子量約為130kDa的GST-USP26融合蛋白，與USP26(分子量約為104kDa)和GST(分子量為26kDa)的理論分子量相符，并且在15℃、37℃分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4小時此融合蛋白均不溶。
　　 (4)兩種去泛素化酶活性檢測方法得到一致的結(jié)果pGEX-6P

11、-1質(zhì)粒（陰性對照）與C304S突變無活性，而USP46（陽性對照）有一定活性，6種SNP活性均與野生型USP26相似，且都較強于USP46。圖像上顯示為質(zhì)粒pGEX-6p-1以及C304S不能將45kDa的GST-Ub52切斷成36kDa的產(chǎn)物，其余6種SNP以及野生型USP26均將GST-Ub52完全切成36kDa的產(chǎn)物，而USP46可將GST-Ub52部分切成36kDa的產(chǎn)物;而令一種檢測體系，質(zhì)粒pAC-T7以及C304S有兩條

12、帶，最上面為底物Ub-Met-β-gal，最下面為內(nèi)源性β-gal蛋白。USP46有三條帶，不僅有上面的兩條帶，還有中間的底物Ub-Met-β-gal被去泛素化的產(chǎn)物Met-β-gal。6種SNP均有中間和下面的兩條帶。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功克隆出人泛素特異性蛋白酶USP26基因。
　　 2、USP26基因編碼序列為2742bp，編碼913個氨基酸，推測分子量為104kDa，而GST分子量為26kDa，所