指狀青霉（Penicillium digitatum）再生體系的建立以及CYP51基因功能初探.pdf

1、通過(guò)對(duì)制備材料、酶液濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度等因素的實(shí)驗(yàn)研究,得到了一套制備指狀青霉(Penicillium digitatum)原生質(zhì)體的有效方法,并在雙層培養(yǎng)基上初步實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體的再生,再生率可達(dá)24.9％.此外,還對(duì)原生質(zhì)體的釋放和再生方式進(jìn)行了跟蹤觀察.原生質(zhì)體釋放有頂端、側(cè)端和原位釋放3種方式.原生質(zhì)體的再生有2種方式,一種是原生質(zhì)體一端突出形成酵母出芽狀細(xì)胞;另一種是在原生質(zhì)體一端直接長(zhǎng)出菌絲.該

2、研究構(gòu)建了指狀青霉對(duì)抑霉唑敏感和抗性的兩個(gè)CYP51基因的pCB1004表達(dá)載體,并對(duì)基因的插入方向和拷貝數(shù)進(jìn)行了分析,證明了兩個(gè)載體連接的基因均為正向連接和單拷貝插入.采用PEG法和電擊法兩種方法進(jìn)行指狀青霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,然后將得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到查氏再生培養(yǎng)基中培養(yǎng),遺憾的是沒(méi)有得到理想的轉(zhuǎn)化子.采用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)分析了對(duì)抑霉唑敏感和抗性的兩種指狀青霉菌株(分別為pd23和pd07)中游離麥角甾醇的含量并比較了兩者之

3、間的差異.結(jié)果表明,在抗性菌株pd07不加抑霉唑的情況下,pd07和pd23中游離麥角甾醇的含量采用Duncan's新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)在5％水平?jīng)]有明顯差異;但當(dāng)pd07中加入0.1μg/ml抑霉唑時(shí),三次重復(fù)測(cè)定結(jié)果顯示抗性菌株pd07中麥角甾醇的含量明顯地要比敏感菌株pd23中的含量高,而且兩者在5％水平上差異顯著.推測(cè)抗性菌株中麥角甾醇含量的積累是需要抑霉唑等藥物誘導(dǎo)的.與敏感菌株相比,抗性菌株CYP51基因啟動(dòng)子上游多了4個(gè)126bp